水稻CDPKs基因的表達(dá)及其功能研究.pdf

1、植物鈣依賴的蛋白激酶(CDPKs)是細(xì)胞鈣信號(hào)的受體，在植物生長發(fā)育、病原防御、非生物環(huán)境脅迫、離子通道運(yùn)輸?shù)壬矸磻?yīng)的信號(hào)傳遞過程中起著重要的調(diào)控作用。水稻存在多個(gè)CDPKs基因，有少數(shù)幾個(gè)基因的功能比較清楚，它們與水稻的發(fā)育或脅迫響應(yīng)有關(guān)，其它大多數(shù)基因的功能有待進(jìn)一步研究。本研究首先分析了水稻CDPKs基因啟動(dòng)子區(qū)的脅迫響應(yīng)元件，然后利用RT-PCR和Northern blot雜交技術(shù)并結(jié)合水稻表達(dá)數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)，對(duì)CDPKs基因在

2、不同脅迫環(huán)境和不同水稻組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況進(jìn)行了分析，根據(jù)表達(dá)結(jié)果鑒定出脅迫響應(yīng)基因；選取OsCPK8和OsCPK6基因，利用RNAi抑制基因表達(dá)技術(shù)和超表達(dá)技術(shù)對(duì)它們的功能進(jìn)行了分析，分別明確了它們?cè)谒局旮叩男螒B(tài)建成和非生物脅迫響應(yīng)中的作用。 本研究獲得的主要研究結(jié)果如下： 1.水稻 CDPKs 基因的表達(dá)分析 (1)通過對(duì)CDPKs保守序列的搜索分析，在水稻基因組中鑒定出29個(gè)CDPKs基因，它們具有典型的

3、CDPKs結(jié)構(gòu)域，即Ser/The蛋白激酶區(qū)、鈣調(diào)素類似結(jié)構(gòu)域。 (2)29個(gè)CDPKs基因啟動(dòng)子區(qū)域均含有數(shù)量不等的多種調(diào)控脅迫響應(yīng)的順式元件，暗示這些基因可能與這些脅迫響應(yīng)有關(guān)。這些元件包括ABA響應(yīng)元件EBOXBNNAPA，光調(diào)控元件 IBOXCORE、脫水響應(yīng)元件MYBCORE、MYCATRD22、DRECRTCOREAT，低溫響應(yīng)元件LTRECOREATCOR15，熱激響應(yīng)元件CCAATBOX和防衛(wèi)反應(yīng)元件WBOXAT

4、NPR1。 (3)在水稻表達(dá)數(shù)據(jù)庫中檢索出11個(gè)與水稻CDPKs基因?qū)?yīng)的ESTs，它們對(duì)低溫、干旱、高鹽、幾丁質(zhì)激發(fā)子處理和稻瘟病病菌侵染等脅迫表現(xiàn)出廣泛的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)。 (4)根據(jù)水稻CDPKs基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的組織特異性，可將水稻CDPKs基因分為7類；新篩選出3個(gè)受脅迫誘導(dǎo)發(fā)生表達(dá)變化的水稻CDPKs基因，OsCPK6、OsCPK17和OsCPK25，其中OsCPK6受干旱和鹽脅迫誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄表達(dá)上升，OsCPK17在低溫、

5、干旱和鹽脅迫刺激下轉(zhuǎn)錄量下降，OsCPK25受熱激誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄量上升。這些脅迫誘導(dǎo)基因在水稻對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)中可能起著重要作用。 2.OsCPK8 基因功能分析 (1)運(yùn)用RNAi技術(shù)構(gòu)建了OsCPK8 基因的抑制表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化水稻，大部分轉(zhuǎn)基因植株較野生型植株高度降低，植株矮小的原因主要是節(jié)間縮短，倒1、2、3節(jié)間和穗長的變化對(duì)植株高度變化的影響最大。 (2)對(duì)OsCPK8基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)基因植株的高度進(jìn)行共分離檢測(cè)

6、，結(jié)果表明株高與OsCPK8基因的RNA表達(dá)量呈現(xiàn)出共分離，矮化植株中OsCPK8基因的表達(dá)受到抑制，轉(zhuǎn)錄量有不同程度的下降。說明OsCPK8基因表達(dá)量的下降是植株變矮的原因。 (3)水稻內(nèi)源赤霉素含量測(cè)定表明，OsCPK8 RNAi矮化植株內(nèi)源GA<,3>含量顯著低于野生型植株的水平；施用外源赤霉素，矮化植株的株高有一定程度的回復(fù)，但不能回復(fù)到野生型水平；對(duì)幼苗進(jìn)行赤霉素敏感性分析的結(jié)果表明，矮化植株對(duì)赤霉素不如野生型敏感。這

7、些結(jié)果表明OsCPK8 RNAi矮化植株的赤霉素合成和信號(hào)傳遞途徑均可能受到阻礙。 (4)OsCPK8 RNAi矮化植株中赤霉素合成相關(guān)基因OsGA2ox1和OsGA2ox2，以及赤霉素信號(hào)調(diào)控基因OsGAI的轉(zhuǎn)錄表達(dá)發(fā)生了改變，在此基礎(chǔ)上提出了OsCPK8的信號(hào)通路假設(shè)。 (5)對(duì)OsCPK8 RNAi矮化植株進(jìn)行的細(xì)胞學(xué)分析表明，矮化植株節(jié)間的伸長區(qū)細(xì)胞縱向長度變短，這可能是植株矮化的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。 3.OsC

8、PK6 基因功能分析 (1)利用RT-PCR技術(shù)從水稻中分離出OsCPK6基因的全長cDNA片段，根據(jù)其核苷酸序列推測(cè)的氨基酸肽鏈包含508個(gè)氨基酸，具有典型的鈣依賴的蛋白激酶結(jié)構(gòu)。OsCPK6定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞核。 (2)將OsCPK6全長cDNA片段置于CaMV 35S啟動(dòng)子的調(diào)控下導(dǎo)入水稻，獲得16個(gè)單拷貝轉(zhuǎn)基因植株，RNA水平的表達(dá)分析表明，轉(zhuǎn)基因植株中OsCPK6基因轉(zhuǎn)錄量比非轉(zhuǎn)化對(duì)照高。 (3)干旱和

9、鹽脅迫試驗(yàn)表明，3個(gè)轉(zhuǎn)OsCPK6基因株系S1、S3和S5在脅迫下的萎蔫苗率明顯低于非轉(zhuǎn)化對(duì)照，說明OsCPK6超表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)干旱和鹽脅迫的耐性增強(qiáng)。 (4)對(duì)轉(zhuǎn)OsCPK6基因水稻進(jìn)行生理分析表明，在脅迫環(huán)境下轉(zhuǎn)基因水稻葉片中脯氨酸含量較非轉(zhuǎn)化對(duì)照植株高，這可能是轉(zhuǎn)OsCPK6基因水稻抗逆性增強(qiáng)的生理原因。 (5)轉(zhuǎn)基因水稻中OsCPK6的超表達(dá)使得脅迫誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子基因SNAC1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)增強(qiáng)，OsCPK6可能通過