胰高血糖素樣肽-1在臍帶間充質(zhì)干細胞治療缺血性腦血管病中的實驗研究.pdf

1、腦血管疾病是目前人類疾病中僅次于心臟病和腫瘤的第三大死亡原因。其中缺血性腦血管病約占全部腦卒中的60％～80％。溶栓治療是目前治療缺血性腦卒中較為成功的方法。但是由于溶栓治療時間窗狹窄和其嚴格的適應癥及可能的嚴重副反應等限制，僅1％左右的腦卒中患者能夠接受溶栓治療，并且溶栓治療的康復率只有30-35％。因此，廣大的科研和臨床工作者都在積極探索有效治療缺血性腦血管病的方法。
　　 近十余年隨著神經(jīng)影像學和分子生物學技術的發(fā)展，缺血

2、性腦損傷機制的研究已取得了巨大的進步。缺血誘導的細胞凋亡和細胞壞死，缺血后腦內(nèi)的免疫應答、炎性反應和氧化應激等的相互作用在缺血性腦卒中的腦損傷過程中占有重要的地位。其中氧化應激被認為是疾病發(fā)生發(fā)展的一個中心環(huán)節(jié)。缺血性腦卒中理想的治療要求針對其病理生理機制，且有較長的治療時間窗，副作用少，方便實施。
　　 伴隨干細胞技術和基礎研究的發(fā)展，細胞治療成為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病，特別是卒中的最有前景的治療方法之一。干細胞移植治療可以通過修復

3、宿主神經(jīng)通路，誘導神經(jīng)重塑和新血管形成，分泌營養(yǎng)因子，召集內(nèi)源性前體細胞等機制的共同作用促進神經(jīng)功能恢復。并且可靜脈輸注，方便實施。治療時間窗可為腦缺血后數(shù)小時到數(shù)周。近來臍帶間充質(zhì)干細胞(hUC-MSCs)成為干細胞治療的理想種子細胞，因其不但具有骨髓間充質(zhì)干細胞的特點，并且干細胞更原始，端粒更長，活細胞數(shù)量更豐富，增殖能力更強，來源豐富，提取簡單，不悖倫理，操作無創(chuàng)等一系列優(yōu)勢。
　　 但是目前基礎和臨床的干細胞移植研究結果

4、卻未能帶給人們預期的結果。其中可能的因素是體內(nèi)的局部病理環(huán)境限制了移植干細胞的存活和功能，如何提高移植細胞的存活和功能，成為目前人們關注的焦點和研究熱點。干細胞移植治療要取得理想的效果，還應根據(jù)患者的病理生理狀況，制定相應的方案，使得進入體內(nèi)的干細胞能夠達到足夠的數(shù)量，并能充分發(fā)揮其功能。針對缺血性腦血管病的病理生理機制的關鍵環(huán)節(jié)——氧化應激，減少其對間充質(zhì)干細胞的損傷，無疑是提高干細胞療效的一個可行方案。
　　 胰高血糖素樣肽

5、1（glucagon-likepeptide1，GLP-1）是營養(yǎng)攝入后刺激腸道L細胞分泌的30個氨基酸殘基的肽類激素，由胰高血糖素原基因表達形成的腸促胰島素。GLP-1已經(jīng)成為治療2型糖尿病的新型藥物，應用于臨床治療。GLP-1的基礎研究顯示GLP-1不僅對胰腺有重要的作用，可以促進放大葡萄糖依賴的β細胞胰島素分泌，減少胰島素β細胞的凋亡，增加其新生，減少胰高血糖素的分泌，減慢胃排空，增加飽感，增加外周葡萄糖的清理。而且GLP-1在中

6、樞神經(jīng)系統(tǒng)也具有重要的生理作用:GLP-1可以通過血腦屏障，促進神經(jīng)軸突的生長和細胞存活，上調(diào)神經(jīng)遞質(zhì)和酶的產(chǎn)生。GLP-1還被認為是一種生長因子，可促進有絲分裂，細胞生長，分化，并能打斷凋亡前過程。GLP-1通過與GLP-1R的結合發(fā)揮上述眾多的作用。有關研究還發(fā)現(xiàn)GLP-1可以防御氧化應激損傷，保護神經(jīng)元抵御氧化應激損傷所導致的細胞死亡。GLP-1在臍靜脈內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞及心肌細胞等都可以發(fā)揮抗氧化損傷的作用，一項采用大鼠大腦中動

7、脈梗死模型的研究發(fā)現(xiàn)，Exending-4預處理與對照組相比可減少梗死體積的50％，并可提高短期的神經(jīng)功能。研究發(fā)現(xiàn)在骨髓間充質(zhì)干細胞上有GLP-1受體表達，并且GLP-1可促進骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖，保護其維持未分化的作用，減少血清剝奪所誘導的骨髓間充質(zhì)細胞的凋亡。
　　 關于GLP-1在臍帶間充質(zhì)干細胞中的表達和功能目前還尚未見報道，本課題旨在研究GLP-1是否可以協(xié)同增強臍帶間充質(zhì)干細胞治療缺血性腦血管的作用，具體步驟是通

8、過臍帶間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)，建立穩(wěn)定的細胞培養(yǎng)體系，進一步研究:1臍帶間充質(zhì)干細胞上GLP-1受體的表達;2GLP-1對臍帶間充質(zhì)干細胞在氧化應激損傷條件下的保護作用及可能機制;3GLP-1在臍帶間充質(zhì)干細胞移植治療缺血性卒中的可能機制，可否減少神經(jīng)元凋亡，促進神經(jīng)元新生和血管新生。各部分研究結果將簡述如下:一、hUC-MSCs的分離培養(yǎng)和鑒定
　　 采用直接組織塊法分離培養(yǎng)hUC-MSCs，通過形態(tài)學觀察、細胞周期測定及流式

9、細胞儀分析其表面標記(CD29，CD34，CD44，CD45，CD105，HLA-DR)和成骨、成脂肪誘導分化鑒定hUC-MSCs。結果顯示，hUC-MSCs呈長梭形，貼壁生長，細胞周期分析絕人多數(shù)處于G0/G1期，表面標志檢測CD34和CD45、HLA-DR為陰性，CD29，CD44、和CD105均為陽性。成骨和成脂誘導可以使hUC-MSCs出現(xiàn)鈣鹽沉積和脂滴，分化為成骨樣細胞和脂肪樣細胞，確定了所培養(yǎng)的細胞是高純度的符合干細胞特征的

10、hUC-MSCs。本部分實驗建立了hUC-MSCs的穩(wěn)定培養(yǎng)體系，為后續(xù)實驗提供了穩(wěn)定優(yōu)質(zhì)的細胞來源。
　　 二、hUC-MSCs的GLP-1受體鑒定
　　 GLP-1受體的表達是GLP-1發(fā)揮作用的結構基礎。本實驗以人臍帶間充質(zhì)干細胞為研究對象，人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)為陽性對照，人肝癌細胞株HepG2為陰性對照。通過RT-PCR方法鑒定人臍帶問充質(zhì)干細胞GLP-1受體的mRNA，用Westernblot檢測有無

11、GLP-1受體表達。細胞免疫熒光實驗以人肝癌細胞株HepG2為陰性對照，并進行DAPI和FITC細胞免疫熒光雙染，用激光共聚焦顯微鏡進行觀察。結果顯示，RT-PCR可以檢測到GLP-1RmRNA表達，Westernblot可以檢測到GLP-1R表達，但略弱于HUVEC。細胞免疫熒光結果顯示為DAP1和FITC雙陽性。上述結果從mRNA和蛋白水平驗證了hUC-MSCs表達GLP-1R，為后續(xù)的體外實驗奠定了結構基礎。
　　 三、G

12、LP-1對hUC-MSCs氧化應激損傷的保護作用及機制研究
　　 以正常培養(yǎng)基為對照組，以不同濃度過氧化氯（1OμMoI/L，20μMol/L,50μMol/L）作用hUC-MSCs2小時，以細胞活性、細胞凋亡率為檢測指標，建立氧化應激損傷的細胞模型。進一步以不同濃度的GLP-1（1Onmol/L20nmol/L30nmol/L）作用于氧化應激損傷細胞模型，篩選出GLP-l的最佳作用濃度。為探討GLP-1的作用機制進行如下實驗:

13、正常對照組，氧化應激組，GLP-1處理組(20nmol/L)，Exending9-39+GLP-1處理組，P13K/Akt通路阻斷劑LY294002+GLP-1處理組。分別選用流式細胞儀檢測AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡，CCK-8試劑盒檢測細胞活性，觀察各組的細胞凋亡和細胞活性。結果顯示過氧化氫對臍帶間充質(zhì)細胞的細胞活性及凋亡的影響呈濃度依賴方式，以20μMol/L過氧化氫處理2小時為合適的細胞氧化應激損傷模型。20nmol

14、/1為GLP-1對抗過氧化氫損傷的最佳作用濃度。GLP-1的保護作用在添加Exending9-39（GLP-1的拮抗劑），LY294002（P13K/Akt通路阻斷劑）后消失。實驗結果提示:GLP-1對hUC-MSCs由過氧化氫誘導氧化損傷具有保護作用，是通過GLP-1與其受體結合，進一步通過PI3K/AKT細胞信號通路實現(xiàn)。
　　 四、GLP-1聯(lián)合hUC-MSCs移植治療大鼠腦缺血模型的作用及機制初步研究
　　 建立

15、大鼠大腦中動脈梗塞模型，實驗分為正常對照組，大鼠中動脈梗死組(MACO)，GLP-1治療組(缺血后給予腹腔注射90ng/100g)，hUC-MSCs移植治療組（缺血后48小時給予尾靜脈注射hUC-MSCslx106，1ml），hUC-MSCs+GLP-1聯(lián)合治療組（缺血后給予腹腔注射90ng/l00g，缺血后48小時給予尾靜脈注射UC-MSC1x106，1ml)。并按照時間分為1,3，7，14天四個亞組。分別在第7和第14天觀察一般狀況

16、（體重，血糖），各亞組進行神經(jīng)功能缺損評分后處死。正常對照組取腦海馬部位免疫組化檢測GLP-1受體。同時分別用免疫組化檢測DCX觀察新生神經(jīng)元，檢測CD31，a-SMA觀察新生血管，c-fos檢測缺血灶周圍凋亡細胞。結果顯示:模型組大鼠血糖與其他各組比較有升高，考慮為腦梗塞引起的應激有關。各組大鼠的體重比較無統(tǒng)計學意義。各治療組大鼠神經(jīng)功能均有改善，以聯(lián)合治療組顯著。C-fos免疫組化結果顯示GLP-1組神經(jīng)元凋亡顯著少于模型組，GLP