乙肝病毒X蛋白通過與survivin和HBXIP形成復合物發(fā)揮致癌作用.pdf

1、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的持續(xù)感染與肝癌的發(fā)生具有十分密切的關(guān)系,由乙肝病毒X開放讀碼框編碼的X蛋白(HBx)可通過蛋白和蛋白的相互作用作為反式激活因子在肝癌的發(fā)生中起重要作用。然而,HBx的致癌作用機理目前仍不十分清楚。我們前期研究工作發(fā)現(xiàn),在肝癌組織中乙型肝炎病毒x抗原(HBxAg)和survivin均有較高水平的表達。因此,我們提出"HBx和survivin協(xié)同轉(zhuǎn)化"。為了進一步闡明HBx與肝癌發(fā)

2、病的關(guān)系,本研究應用人肝細胞系和鼠纖維母細胞系,探討了HBx與survivin協(xié)同轉(zhuǎn)化致癌作用的分子機制,主要研究內(nèi)容如下:
　　 一、建立穩(wěn)定表達HBx和/或survivin的細胞系
　　 為了探討乙肝病毒X蛋白在肝癌發(fā)生中的作用,建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染所研究基因的細胞模型具有十分重要的意義。本研究通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將克隆有乙肝病毒X基因和survivin基因的質(zhì)粒分別和共同導入培養(yǎng)的人肝細胞系L-O2和鼠纖維母細胞系N1H3T3

3、中,經(jīng)G-418篩選,獲得了穩(wěn)定細胞系,分別將其命名為L-O2-P/3T3-P(轉(zhuǎn)染空載體),L-O2-X/3T3-X(轉(zhuǎn)染X基因),L-O2-S/3T3-S(轉(zhuǎn)染survivin基因),L-O2-XN-SC/3T3-XN-SC(轉(zhuǎn)染X基因和survivin基因的突變體)和L-O2-X-S/3T3-X-S(轉(zhuǎn)染X和survivin基因)。利用上述細胞進行基因組PCR和Western blot及免疫熒光檢測,顯示L-O2-X/3T3-X和

4、L-O2-X-S/3T3-X-S細胞中存在X基因的整合及X蛋白的表達,L-O2-S/3T3-S和L-O2-X-S/3T3-X-S細胞中存在外源survivin基因的整合及survivin蛋白的表達,L-O2-XN-SC/3T3-XN-SC細胞中存在X基因和survivin基因突變體的整合和相應蛋白的表達。
　　 二、HBx、survivin和HBXIP蛋白三者關(guān)系的研究
　　 在前期實驗結(jié)果和文獻報道的基礎(chǔ)上,應用免疫共

5、沉淀、RNA干擾和激光共聚焦實驗方法,闡明HBx、survivin和HBXIP三者的相互關(guān)系。該研究的主要內(nèi)容有以下幾個方面:第一,用人肝細胞系L-O2,通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)瞬時過表達X蛋白和survivin蛋白后進行免疫共沉淀實驗。結(jié)果顯示,HBx與survivin相互結(jié)合。第二,我們建立了穩(wěn)定干擾HBXIP的L-O2細胞系并命名為L-O2-pSi-XIP。在此細胞中過表達X蛋白和survivin蛋白。免疫共沉淀實驗顯示,HBx、surv

6、ivin和HBXIP三者能相互結(jié)合,重要的是結(jié)果顯示,HBx和survivin的結(jié)合通過HBXIP來實現(xiàn)。第三,激光共聚焦實驗顯示,在L-O2-X-S細胞內(nèi)HBx和survivin蛋白能夠共定位。
　　 三、三者復合物的惡性轉(zhuǎn)化作用
　　 為了闡明上述各個細胞系的惡性表型,進行了免疫印跡實驗。結(jié)果顯示,在L-O2-X和L-O2-X-S細胞中有甲胎蛋白(AFP)的表達,初步顯示這些細胞發(fā)生了轉(zhuǎn)化。對癌蛋白的檢測發(fā)現(xiàn),L-O

7、2-X-S/3T3-X-S具有轉(zhuǎn)化細胞的特征,細胞惡性表型明顯強于L-O2-X/3T3-X和L-O2-S/3T3-S細胞系,癌蛋白呈高水平表達。進一步克隆形成實驗的結(jié)果顯示,L-O2-X-S細胞克隆形成能力相比其他細胞系顯著增強。將L-O2、L-O2-P、L-O2.X、L-O2-S、L-O2-XN-SC和L-O2-X-S細胞接種裸鼠后,L-O2、L-O2-P、L-O2.S和L-O2-XN-SC細胞系不能使裸鼠成瘤；L-O2-X細胞接種的

8、裸鼠8只中有3只成瘤；L-O2-X-S細胞接種的裸鼠8只全部成瘤。
　　 四、三者復合物致癌分子機制的研究
　　 在上述研究基礎(chǔ)上,為了闡明三者復合物致癌作用的分子機制,從以下幾個方面進行了探索。
　　 第一,三者復合物各自在致癌中所扮演的角色。在L-O2和NIH3T3系統(tǒng)中的報告基因?qū)嶒烇@示,只有HBx和survivin同時存在,報告基因的活性才顯著增強,表明HBx和survivin能夠協(xié)同發(fā)揮轉(zhuǎn)化功能。結(jié)合R

9、NA干擾、免疫印跡和報告基因等技術(shù)手段,我們發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)化過程中HBx起主要作用。進而,在L-O2-X和3T3-X兩個系統(tǒng)內(nèi),瞬時轉(zhuǎn)染survivin、survivin突變體和HBXIP,然后進行報告基因活性的檢測。結(jié)果顯示,survivin在HBx的致癌作用中發(fā)揮了重要功能。
　　 第二,HBXIP在協(xié)同轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮功能的研究。借助免疫印跡技術(shù)我們發(fā)現(xiàn)僅在L-O2-X-S/3T3-X-S中HBXIP的蛋白表達水平大大增加,其他細

10、胞中HBXIP蛋白表達水平無變化。進而我們設(shè)計并克隆了HBXIP的兩個突變體分別命名HBXIPN83(與HBx結(jié)合的部位)和HBXIPC91(與survivin結(jié)合的部位)。在L-O2-X-S/3T3-X-S系統(tǒng)中瞬時轉(zhuǎn)染HBXIP、HBXIPN83、HBXIPC91和HBXIP干擾載體。我們發(fā)現(xiàn),過表達HBXIP后報告基因的活性增加,而對HBXIP進行RNA干擾以后報告基因的活性顯著降低,過表達HBXIP的兩個突變體作用不明顯。以上結(jié)

11、果說明,當HBXIP被RNA干擾后,三者復合物不能形成,轉(zhuǎn)化作用不能發(fā)生。
　　 第三,轉(zhuǎn)化過程中microRNA表達譜和基因表達譜的研究。①與L-O2-X和L-O2-S細胞相比,L-O2-X.S細胞中有33種microRNA的表達發(fā)生了變化。其中有14種microRNA上調(diào)表達(比值≥2.0),19種microRNA下調(diào)表達(比值≤0.5)。我們從芯片檢測結(jié)果中選出兩個上調(diào)表達和兩個下調(diào)表達的mieroRNA進行了real-t

12、ime qRT-PCR驗證,顯示與芯片獲得的結(jié)果一致。②根據(jù)數(shù)據(jù)庫預測,has-miR-520b和has-miR-520e可能靶向HBXIP。我們?nèi)斯ず铣闪诉@兩種microRNA和相應的對照序列。實驗結(jié)果顯示has-miR-520b靶向HBXIP。③應用基因芯片技術(shù)比較了L-O2、L-O2-X和L-O2-X-S細胞,檢測了細胞中基因表達譜的變化。比較L-O2-X和L-O2(對照組)細胞,發(fā)現(xiàn)150個有明顯差異的基因,呈上調(diào)表達(比值≥2

13、.0)的基因有80個,呈下調(diào)表達(比值≤0.5)的基因有70個。前期實驗結(jié)果表明L-O2-S細胞沒有發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化,因而比較L-O2-X-S和L-O2-X細胞,然后去除L-O2-X和L-O2比較后得出一個基因表達譜——協(xié)同轉(zhuǎn)化相關(guān)的基因表達譜。結(jié)果顯示,有78個有明顯差異的基因,被上調(diào)表達的基因有24個,呈下調(diào)表達的基因有54個；我們從基因芯片中選出兩個基因(PCNA和Bel-2)進行了免疫印跡驗證,顯示與芯片獲得的結(jié)果一致。差異表達的基

14、因功能廣泛涉及到細胞增殖、細胞分化和轉(zhuǎn)化等多方面。
　　 綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)在HBx的導致的惡性轉(zhuǎn)化過程中,HBx、survivin和HBXIP三者形成復合物協(xié)同發(fā)揮轉(zhuǎn)化功能。HBx和survivin扮演了至關(guān)重要的角色,其中HBx作為誘導因子發(fā)揮主要功能,survivin也發(fā)揮了重要的作用,而HBXIP發(fā)揮橋梁的功能連接HBx和survivin,通過三者形成的復合物發(fā)揮致癌功能。轉(zhuǎn)化過程中,microRNA has-miR-5