Ghrelin與胰島β細(xì)胞功能之間關(guān)系的初步研究.pdf

1、本文應(yīng)用免疫化學(xué)染色和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)的方法，確定ghrelin及其受體在胰腺組織和離體胰島β細(xì)胞中是否表達(dá)，研究ghrelin對胰腺β細(xì)胞胰島素釋放的影響，并從信號傳導(dǎo)和細(xì)胞增殖兩個方面對其作用機(jī)制進(jìn)行探討。 材料與方法： 1 選取成人胰腺組織進(jìn)行胰島素與ghrelin的免疫熒光雙標(biāo)記染色，并利用不同周齡胎兒胰腺組織冰凍切片進(jìn)行g(shù)hrelin免疫組化染色，觀察ghrelin在胰腺組織中的表達(dá)及在胰腺

2、發(fā)育過程中的動態(tài)變化。 2 采用RT-PCR方法，檢測小鼠胰腺組織和小鼠胰腺β細(xì)胞系NIT-1細(xì)胞中GHS-R的表達(dá)。 3 NIT-1細(xì)胞與不同濃度(0、10<'-11>、10<'-10>、10<'-9>、10<'-8>、10<'-7>mol/L)的ghrelin和(或)高濃度葡萄糖(25mmol/L)孵育60min后，應(yīng)用放免法(RIA)測定上清液胰島素含量。 4 NIT-1細(xì)胞與10<'7>mol/L ghr

3、elin和(或)高濃度葡萄糖孵育60min后，提取細(xì)胞總RNA，采用RT-PCR檢測葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子2(GLUT2)、胰十二指腸同源盒-1(PDX-1)、含兩個跨膜區(qū)的內(nèi)向整流鉀通道(Kir6.2)、磺酰脲受體1(SUR1)等基因的表達(dá)情況。 5 10<'-4> mol/L ghrelin和(或)高濃度葡萄糖處理NIT-1細(xì)胞前后，利用激光共聚焦成像觀察單個細(xì)胞鈣離子內(nèi)流的情況。 6 NIT-1細(xì)胞與不同濃度(0、10<'-11>、

4、10<'-9>、10<'-7>mol/L)ghrelin孵育不同時間(0、24、48、72h)，應(yīng)用MTr法測定570nm吸光度(OD<,570>)，來間接反映細(xì)胞的增殖情況。 結(jié)果： 1 免疫組織化學(xué)染色顯示，16-33周的胎兒胰腺組織中g(shù)hrelin陽性細(xì)胞數(shù)目隨胎齡增長而增加，以28周至33周為最多，而在成人胰腺組織中則相對較少。 2 RT-PCR顯示，ghrelin受體(GHS-R)mRNA在小鼠胰腺組織

5、和小鼠胰腺β細(xì)胞株NIT-1細(xì)胞中均有表達(dá)。 3 10<'-9> mol/L至10<'-7> mol/L的ghrelin呈劑量依賴性抑制小鼠NIT-1細(xì)胞高濃度葡萄糖刺激的胰島素釋放。 4 Ghrelin下調(diào)Kir6.2 mRNA的表達(dá)，但對GLUT1、PDX-1及SUR1 mRNA的表達(dá)則無顯著的影響。 5 在高濃度葡萄糖存在前提下，ghrelin有抑制NIT-1細(xì)胞鈣離子內(nèi)流的趨勢。 6 Ghreli

6、n對NIT-1細(xì)胞增殖無明顯的效應(yīng)。 結(jié)論： 1 胎兒胰腺組織中g(shù)hrelin陽性細(xì)胞數(shù)目在28周至33周達(dá)到高峰，而在成人胰腺組織中則相對較少。 2 GHS-R在小鼠胰腺組織和小鼠胰腺β細(xì)胞株NIT-1細(xì)胞中均有表達(dá)。 3 Ghrelin呈劑量依賴性抑制NIT-1細(xì)胞高濃度葡萄糖刺激的胰島素釋放。上述抑制性效應(yīng)可能是由于下調(diào)ATP敏感性鉀通道組成成分Kir6.2基因的表達(dá)從而引起β細(xì)胞鈣離子內(nèi)流受抑制所