B7-H4分子的抗體制備及其在腫瘤研究中的應用.pdf

1、B7—H4，又稱B7S1或B7x，是共刺激分子B7家族的最新成員，為Ⅰ型跨膜糖蛋白，編碼282個氨基酸。由美國Mayo醫(yī)學中心于2003年發(fā)現(xiàn)，是B7家族相關的第3個T細胞抗原特異性反應的負性調(diào)控分子。人B7—H4的cDNA長約1.8Kb，位于人的染色體1p11.1，在基因組上跨越66Kbp。B7—H4的mRNA在淋巴和非淋巴組織中都有表達，但免疫組化顯示，B7—H4蛋白僅在部分正常組織中微弱的表達。B7—H4可以在活化的人T細胞、B細

2、胞、巨噬細胞、DC細胞上呈誘導性表達。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，一些腫瘤細胞也呈組成性表達B7—H4，如乳腺癌、卵巢癌和肺癌等。對小鼠組織的Northern Blot實驗發(fā)現(xiàn)，根據(jù)組織類型的不同，小鼠的B7—H4共有四種不同的mRNA剪切形式。RT-PCR分析顯示，人類的組織至少擁有兩個轉(zhuǎn)錄本。研究表明，正常外周組織能在翻譯水平對B7—H4的表達進行嚴密的調(diào)控。 在機體的免疫應答過程中，B7—H4作為重要的共刺激分子，在CD4+、CD8+T細胞

3、的分化發(fā)育、細胞周期進展以及細胞因子的產(chǎn)生等方面發(fā)揮廣泛的抑制效應。B7—H4對外周組織的細胞免疫應答起著負性調(diào)節(jié)的作用，且由于其特異性表達于某些腫瘤細胞表面，因而可能在機體的腫瘤免疫逃避機制中起著重要作用。 因此，B7—H4分子途徑為腫瘤、自身免疫性疾病和抗病毒及移植排斥反應等疾病提供了新的治療思路。阻斷B7—H4與其受體的相互作用，有望成為干預自身免疫性疾病和腫瘤生物治療的潛在靶點。 目的：為了更深入研究B7—H4與

4、腫瘤免疫的關系，本實驗設計并合成了人B7—H4多肽，應用該多肽制備了兔抗人B7—H4多克隆抗體，并應用該抗體研究B7—H4分子在多種腫瘤細胞和腫瘤組織中的表達，并探討其意義。 方法： 1．根據(jù)GenBank公布的序列(AAP37283)，利用計算機輔助設計，確定并人工合成B7—H4抗原多肽，并用Keyhole Limpet Hemocyanin(KLH)交聯(lián)以增強B7—H4抗原多肽的免疫原性。將交聯(lián)KLH的B7—H4抗原

5、肽免疫新西蘭兔(經(jīng)初次免疫和四次加強免疫)后獲取免疫兔血清，親和純化法純化兔血清中的抗B7—H4抗體。采用直接ELISA法，Western—blot免疫印跡鑒定抗B7—H4抗體的效價、反應的特異性和敏感性； 2．免疫組織化學染色檢測組織芯片上多種腫瘤組織中人B7—H4蛋白的表達情況； 3．根據(jù)GenBank公布的序列(NM_024626)，合成了hB7—H4的PCR引物，應用RT-PCR檢測多種腫瘤細胞株中人B7—H4m

6、RNA的表達； 4．Western—Blot檢測多種腫瘤細胞株中人B7—H4蛋白的表達。 結(jié)果： 1．成功制備了兔抗人B7—H4多克隆抗體； 2．免疫組化檢測結(jié)果顯示肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸癌、直腸癌及腎癌等多種腫瘤組織的細胞膜和細胞漿均有B7—H4蛋白的陽性染色，而在各種對照的正常組織中僅表達為陰性至弱陽性； 3．RT-PCR結(jié)果顯示8種腫瘤細胞株在目的條帶1200bp左右處均有B

7、7—H4mRNA的表達； 4．Western—Blot檢測9種細胞株中B7—H4蛋白的表達，結(jié)果顯示A549、MCF-7、SK—BR-3、CaoV3、SK—OV-3、SiHa、HeLa、HepG2等腫瘤細胞株均表達B7—H4蛋白，而A293細胞株未檢測到B7—H4蛋白表達。 結(jié)論： 1．成功制備了兔抗人B7—H4多克隆抗體； 2．肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸癌、直腸癌及腎癌等多種腫瘤組織的細胞膜