人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源exosomes分離鑒定及其對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)作用.pdf

1、目的:分離培養(yǎng)人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs),建立MSCs來(lái)源外切體(MSC-exosomes)分離純化方法,鑒定MSCs來(lái)源的exosomes并初步分析其生物學(xué)特性；體內(nèi)外研究MSC—exosomes對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
　　 方法:采用ficoll密度梯度離心法分離培養(yǎng)人骨髓MSCs；利用超濾及梯度離心法從MSCs培養(yǎng)上清中分離并純化MSC-exosomes,通過(guò)透射電鏡進(jìn)行形態(tài)

2、觀察及Western-blot檢測(cè)exosomes表面相關(guān)蛋白CD9、CD81對(duì)其進(jìn)行鑒定；將分離純化的MSC-exosomes與腫瘤細(xì)胞SGC-7901進(jìn)行BALB／c裸鼠皮下共注射建立皮下致瘤模型,通過(guò)觀察比較致瘤效果和瘤體積的大小來(lái)研究MSC-exosomes在體內(nèi)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響；綜合運(yùn)用組織病理學(xué)、免疫組織化學(xué)、Western blotting及RT-PCR等技術(shù)比較MSC-exosomes與SGC-7901細(xì)胞共注射組與對(duì)照

3、組瘤組織的特性；分別采用MTT法及流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定不同濃度的MSC-exosomes作用SGC-7901細(xì)胞后其增殖活性及細(xì)胞周期的改變來(lái)研究exosomes在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)作用,并通過(guò)RT-PCR及Western blotting檢測(cè)腫瘤血管生長(zhǎng)及細(xì)胞增殖相關(guān)基因或蛋白的變化,初步探討MSC-exosomes對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的可能機(jī)制。
　　 結(jié)果:采用超濾及梯度離心法成功分離純化得到人骨髓MSCs分泌的exosomes,電

4、鏡下MSC-exosomes呈橢圓或碟狀的囊泡結(jié)構(gòu),直徑約40 nm～100 nm。MSC-exosomes含有其來(lái)源MSCs的成分及特征,并表達(dá)exosomes相關(guān)蛋白CD9、CD81；裸鼠皮下致瘤模型發(fā)現(xiàn)MSC-exosomes與SGC-7901共注射組腫瘤的生長(zhǎng)速度較MSCs與SGC-7901共注射組相似,比SGC-7901單獨(dú)接種組腫瘤生長(zhǎng)速度明顯加快。各組腫瘤組織HE染色及α-SMA,VEGF,CD34,FⅧ及PCNA免疫組化

5、染色結(jié)果顯示MSC-exosomes與腫瘤細(xì)胞共注射組的瘤組織含有豐富的血管。體外Western blotting檢測(cè)表明MSC-exosomes能夠引起腫瘤細(xì)胞ERK的瞬時(shí)活化,但MTT分析及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果表明MSC-exosomes體外作用SGC-7901細(xì)胞后其細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞在G0／G1、S及G2／M各階段的比例與未處理的SGC-7901細(xì)胞相比無(wú)明顯差異。
　　 結(jié)論:采用超濾及梯度離心法可以成功從間質(zhì)干細(xì)胞