機(jī)械牽張力與氧化型低密度脂蛋白協(xié)同促進(jìn)大鼠血管平滑肌細(xì)胞脂質(zhì)攝取和MAPKs激活的研究.pdf

1、目的： 用機(jī)械牽張力(stretch stress)和/或氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，oxLDL)刺激大鼠血管平滑肌細(xì)胞(Rat vascular smooth muscle cells，RVSMCs)，研究機(jī)械牽拉力對(duì)RVSMCs攝取oxLDL的影響及其分子機(jī)制，探討高血壓與高血脂協(xié)同促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)發(fā)生的機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)方法

2、： (1)體外分離大鼠主動(dòng)脈中膜，組織塊貼壁法原代培養(yǎng)RVSMCs，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)鑒定(分別用光鏡和Western blot的方法)。 (2)高速離心法分離血漿中的LDL(native LDL，nLDL)，用硫酸銅對(duì)其進(jìn)行氧化，獲得oxLDL；用瓊脂糖凝膠電泳鑒定分離的nLDL和oxLDL。 (3)用nLDL和oxLDL分別培養(yǎng)RVSMCs一定時(shí)間后用油紅染色檢測(cè)細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的攝取，用MTT的辦法檢測(cè)細(xì)胞活

3、性。 (4)不同濃度的nLDL、oxLDL、機(jī)械牽張力分別作用于RVSMCs，用Western blot的方法進(jìn)一步檢測(cè)MAPKs的激活； (5)用oxLDL和機(jī)械牽張力共同作用于RVSMCs，Western blot的方法檢測(cè)MAPKs的磷酸化水平的變化。并利用總膽固醇試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的總膽固醇含量。 結(jié)果： (1)7天左右有細(xì)胞從組織塊中長(zhǎng)出，14天鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶。細(xì)胞呈長(zhǎng)梭型和谷峰樣的外觀(guān)，細(xì)胞表達(dá)平滑肌

4、特異抗原α—actin。 (2)離心后，LDL與血漿其他成分分界清晰，蛋白定量檢測(cè)顯示LDL的濃度較高，瓊脂糖電泳顯示LDL在血漿β脂蛋白對(duì)應(yīng)處，且條帶單一，oxLDL的遷移率明顯高于nLDL； (3)油紅染色顯示nLDL和oxLDL可以誘導(dǎo)RVSMCs細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量增加；10-200μg/ml的nLDL和oxLDL均可使RVSMCs的活性增高，但是相同濃度的oxLDL的作用強(qiáng)于nLDL的作用。 (4)Weste

5、rn blot顯示：機(jī)械牽拉力和oxLDL均可以導(dǎo)致MAPKs的磷酸化，而oxLDL和機(jī)械牽張力可以協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞MAPKs的磷酸化。 (5)總膽固醇實(shí)驗(yàn)顯示：oxLDL以及機(jī)械牽拉力可以分別提高RVSMCs總膽固醇的濃度，而機(jī)械牽張力與oxLDL共同作用可協(xié)同促進(jìn)RVSMCs對(duì)總膽固醇的攝取，亦即：細(xì)胞內(nèi)總膽固醇濃度大于單獨(dú)oxLDL或機(jī)械牽張力刺激的RVSMCs細(xì)胞總膽固醇的濃度。 結(jié)論：機(jī)械牽張力和oxLDL可分別促