腺病毒介導的RPL23基因轉染通過對MDM2-p53反饋環(huán)的調節(jié)抑制p53野生型胃癌細胞的生長.pdf

1、p53的失活是腫瘤轉化過程中最常見的事件之一。人類大部分腫瘤的發(fā)生和發(fā)展同p53的變異和缺失密切相關。p53在人類腫瘤中突變率很高，平均達到50％；盡管如此，仍有約50％的腫瘤表達野生型p53（wt-p53），其中多數(shù)因細胞內降解代謝或下游信號通路的改變而致p53正常功能缺失。
　　MDM2在調節(jié)p53濃度及活性中起關鍵作用。在正常細胞中，MDM2通過對p53蛋白持續(xù)而又快速的降解使p53活性保持在一個適當?shù)乃?，這是生物體維持正

2、常生長的一種平衡調控手段。MDM2本身是p53的轉錄靶基因，因而兩者構成負反饋環(huán)路，調節(jié)p53的穩(wěn)定性。但在一些細胞中，由于基因擴增或其它原因導致MDM2水平的升高，從而導致對p53產生構成性的、非正常的抑制作用，并且不可逆地促使其降解，使p53對細胞正常的調控平衡被破壞，造成細胞生長失控，因而變得具有腫瘤細胞的特性。
　　將p53從被MDM2的抑制中釋放出來或阻斷MDM2與其它基礎轉錄因子的相互作用以恢復p53的正常功能，即可抑

3、制癌的發(fā)生或發(fā)展。已有的研究顯示，核糖體蛋白L23（RPL23）是細胞內調節(jié)MDM2-p53反饋環(huán)的一個重要分子。通過與MDM2的直接結合，RPL23抑制MDM2對p53的泛素化和降解而間接促使wt-p53功能的活化，進而誘導p53依賴的細胞周期阻滯和/或凋亡。此外，研究顯示外源性表達的RPL23在胞核和胞漿內均可與MDM2結合，提示RPL23蛋白可以復合物的形式將MDM2阻滯于胞核或胞漿，進而間接抑制MDM2與p53的結合及對p53的

4、泛素化和降解?；诖?，我們設想以RPL23基因為靶點的腫瘤基因治療是一可行策略。
　　目的：
　　探討腺病毒介導的RPL23基因轉染是否可通過對MDM2-p53相互作用的抑制誘導胃癌細胞內源性wt-p53蛋白的積聚活化并進而抑制其生長。
　　方法：
　　1、利用免疫組織化學染色的方法觀察p53和MDM2在胃癌組織中的表達情況；2、構建rAd5-RPL23重組腺病毒，并利用WesternBlot、免疫沉淀及免疫熒光

5、染色等方法鑒定其對胃癌細胞MDM2-p53反饋環(huán)的調節(jié)；3、應用Ad-RPL23重組腺病毒轉染wt-p53型胃癌細胞系AGS和MKN45，觀察其對胃癌細胞周期和/或凋亡的影響，并進行裸鼠體內成瘤實驗，進一步驗證Ad-RPL23重組腺病毒對p53野生型胃癌的生長抑制作用。
　　結果：
　　1、p53和MDM2在胃癌組織中的表達及意義
　　我們利用免疫組化染色檢測了p53和MDM2在94例胃癌原發(fā)灶中的表達。結果顯示：p5

6、3（突變型）的檢出率為36％（34/94），此外，在這些可以檢出突變型p53蛋白表達的胃癌原發(fā)灶中并非所有癌細胞均是p53陽性表達，其陽性率差異比較大，從10％-99％，均數(shù)約30％，提示在胃癌原發(fā)灶中有更多的癌細胞為p53野生型；在62.8％(59/94)的胃癌原發(fā)灶中可以檢測到MDM2表達，定位于胞漿和胞核，并且呈異質性表達；在我們的研究中亦發(fā)現(xiàn)胃癌淋巴結轉移灶MDM2表達陽性率顯著高于原發(fā)灶，提示MDM2的水平增高可能與胃癌細胞的

7、轉移密切相關。
　　2、Ad-RPL23重組腺病毒的構建及其對MDM2-p53反饋環(huán)的調節(jié)
　　本研究首先利用武漢晶賽公司AdenovirusExpressionSystem重組腺病毒構建系統(tǒng)成功構建了rAd5-RPL23（Ad-RPL23），隨后利用WesternBlot、免疫共沉淀和免疫熒光等方法證實在胃癌細胞系MKN45中外源性RPL23蛋白可與內源性MDM2蛋白相互結合并抑制其E3泛素酶活性，進而誘導wt-p53蛋白

8、的積聚活化。進一步實驗，我們證實Ad-RPL23誘導的p53活化源于其對MDM2降解p53過程的抑制。
　　3、Ad-RPL23轉染對胃癌細胞細胞周期和/或凋亡的影響
　　Ad-RPL23轉染后，p53野生型人胃癌細胞系MKN45和AGS出現(xiàn)G1-S期阻滯，WesternBlot結果顯示，Ad-RPL23轉染的MKN45和AGS細胞p53蛋白表達水平與MDM2蛋白表達水平具有一致性，顯示外源性RPL23表達可抑制MDM2-p

9、53相互作用并引起p53積聚活化，進而誘導p21的表達。此外，在MKN45細胞中，Ad-RPL23轉染可以誘導明顯的細胞凋亡，WesternBlot結果顯示，作為p53轉錄的靶基因，Bax和PUMA，兩個已知的凋亡相關分子，表達均明顯上調。在p53突變型胃癌細胞系MGC803中，Ad-RPL23轉染對細胞周期及凋亡未有影響，顯示外源性的RPL23是通過p53途徑發(fā)揮其抑癌效應的。裸鼠體內成瘤實驗進一步證實了上述結果?？傊?，本實驗提供的數(shù)