通心絡抑制血管內膜增生的作用和機制研究.pdf

1、病理性血管重塑(vascular remodeling)是指血管壁結構對血流變化、機械負荷或者血管損傷所發(fā)生的失代償性改變，進而可導致許多血管疾病的發(fā)生和發(fā)展，比如動脈粥樣硬化、血管成形術后再狹窄以及血管旁路移植失敗等。新生內膜形成是血管重塑的主要病理特征之一，病理學基礎主要為局部炎性細胞的浸潤和中膜平滑肌細胞的增殖和遷移。大量研究表明，炎癥應答在引發(fā)和加劇血管重塑中起關鍵作用，表現(xiàn)為單核/巨噬細胞浸潤以及炎性介質的釋放，由此觸發(fā)血管平

2、滑肌細胞(vascular smoothmuscle cells，VSMCs)向內膜下遷移和增殖，最終導致管腔狹窄甚至閉塞。
　　MicroRNAs(miRNAs)是體內存在的一類非編碼小RNA，長度通常不超過22個核苷酸，主要通過抑制翻譯或促進mRNA降解在轉錄后水平調控基因表達。研究證實，許多miRNAs都參與了血管重塑過程。MicroRNA-155(miR-155)是一個炎癥相關miRNA，在巨噬細胞和動脈粥樣硬化斑塊中表達

3、上調。miR-155通過靶向抑制巨噬細胞炎癥應答來發(fā)揮促炎或抗炎的作用。近期研究表明，miR-155在動脈粥樣硬化中同樣具有抗斑塊形成和促斑塊形成的雙重作用，但其在血管重塑及新生內膜形成中的作用還尚不清楚。
　　通心絡是一種中藥復方提取物，由人參、赤芍、酸棗仁、檀香、降香、土鱉蟲、蜈蚣、水蛭、蟬蛻、全蝎、乳香及冰片組成。該藥已顯示出多種血管保護樣作用，包括降血脂、抗氧化、抗血栓形成、改善內皮細胞功能、促進血管新生以及抑制炎癥反應等

4、?？寡资峭ㄐ慕j發(fā)揮血管保護作用的主要機制之一，miRNA是否介導或參與通心絡抑制血管炎癥反應的過程目前還尚不清楚。因此，本研究利用小鼠頸動脈結扎模型誘導血管內膜增生，探討通心絡是否通過調控miR-155的表達而發(fā)揮抑制血管炎癥及血管重塑的作用，旨在為闡明通心絡的血管保護分子機制以及擴大臨床應用范圍提供實驗依據(jù)。
　　第一部分通心絡抑制頸動脈結扎誘導的內膜增生和血管炎癥反應
　　目的:觀察通心絡對頸動脈結扎誘導的內膜增生和局部

5、炎癥應答中的抑制作用。
　　方法:1于左側頸總動脈近分叉處結扎C57BL/6小鼠頸總動脈誘導內膜增生。2應用蘇木精-伊紅染色和Image-Pro Plus Analyzer version5.1軟件觀察和評價內膜增生的形態(tài)學改變。3 qRT-PCR檢測VEGF-α、FGF-b、TGF-β、PDGF-BB、TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達水平。4應用mac-2和SMA免疫熒光雙重染色觀察巨噬細胞浸潤和血管平滑肌細胞增殖

6、。5免疫組化法觀察TNF-α和IL-1β的表達量。
　　結果:
　　1、通心絡抑制頸動脈結扎誘導的內膜增生
　　形態(tài)學分析顯示，頸動脈結扎7天后既有新生內膜形成，到結扎后14天內膜增生進一步加重，到結扎后21天，新生內膜大量增加至血管壁厚度的70％以上。與結扎組相比，通心絡低劑量、中劑量和高劑量灌胃組（于術前3天開始，每天灌胃給藥一次）結扎血管的內膜面積和I/M比值在3個時間點（7、14和21天）均顯著減少。同時，通心

7、絡中劑量和高劑量灌胃組對內膜增生的抑制作用比通心絡低劑量灌胃組更顯著。以上結果說明，通心絡呈劑量依賴性抑制頸動脈結扎誘導的新生內膜形成。
　　2、通心絡抑制頸動脈結扎誘導的炎性因子的表達
　　qRT-PCR結果顯示，在頸動脈結扎后21天，結扎血管中的TGF-β、PDGF-BB、TNF-α、IL-1β的mRNA水平均比對照組血管顯著升高。尤其是TNF-α的mRNA水平達對照組的17倍。與結扎組相比，通心絡中劑量灌胃組顯著降低了

8、PDGF-BB、TNF-α、IL-1β的mRNA水平，但沒有影響TGF-β的mRNA水平。這些結果說明，通心絡對頸動脈結扎誘導的炎性因子的上調有顯著的抑制作用。
　　3、通心絡抑制頸動脈結扎誘導的巨噬細胞浸潤和血管平滑肌細胞增殖，減少結扎血管中TNF-α和IL-1β的產生
　　免疫熒光結果顯示，在頸動脈結扎后21天的血管新生內膜中有大量巨噬細胞浸潤，同時伴有血管平滑肌細胞的大量增殖。然而，在通心絡中劑量灌胃組的結扎血管中，幾

9、乎觀察不到巨噬細胞的浸潤，中膜平滑肌細胞的增殖和遷移也不明顯。免疫組化顯示，與對照組相比，損傷21天后結扎血管的新生內膜中有大量TN-α、IL-1β的產生，而通心絡中劑量灌胃顯著抑制了結扎血管中TNF-α和IL-1β的表達。
　　4、結扎后再給予通心絡干預仍然可以顯著抑制頸動脈結扎誘導的內膜增生
　　形態(tài)學結果顯示，于頸動脈結扎后3天再給予通心絡中劑量灌胃，與結扎組相比，在術后21天仍然抑制了血管內膜增生，但抑制作用與術前預

10、干預組比較有所減弱。
　　小結:
　　通心絡可以顯著抑制小鼠頸動脈結扎誘導的內膜增生，其作用與減少巨噬細胞浸潤從而減輕局部炎癥反應有關。
　　第二部分通心絡通過下調miR-155的表達發(fā)揮抑制內膜增生的作用
　　目的:觀測miR-155是否參與頸動脈結扎誘導的新生內膜形成過程，以及通心絡是否通過調節(jié)miR-155的表達來發(fā)揮抑制內膜增生和血管炎癥反應的作用。
　　方法:1對miR-155基因敲除(miR-1

11、55-/-)小鼠和野生型(WT)小鼠行左側頸總動脈結扎術。蘇木精-伊紅染色和Image-Pro Plus Analyzerversion5.1軟件觀察和評價內膜增生的形態(tài)學改變。2將腺病毒載體Ad-miR-155（空載體Ad-null作為對照）經尾靜脈注射導入WT小鼠體內過表達miR-155。3 qRT-PCR檢測miR-155、TNF-α和IL-1β的表達水平。4 mac-2免疫組化染色觀察巨噬細胞浸潤;免疫組化染色觀察TNF-α的表

12、達量。
　　結果:
　　1、通心絡抑制頸動脈結扎誘導的miR-155的表達
　　與未結扎的對照組相比，miR-155在頸動脈結扎14天和21天后的小鼠血管中均顯著上調，通心絡中劑量灌胃在結扎后14天和21天均明顯抑制了結扎血管中miR-155的表達。在頸動脈結扎7天后的結扎組和通心絡中劑量灌胃組的血管中miR-155的表達沒有明顯變化。
　　2、 miR-155缺失抑制頸動脈結扎誘導的內膜增生，而miR-155過

13、表達部分拮抗了通心絡對內膜增生的抑制作用
　　形態(tài)學分析顯示，頸動脈結扎21天后，WT小鼠血管中有大量新生內膜形成，而miR-155-/-小鼠的結扎血管，無論是I/M比值還是內膜面積均顯著低于WT小鼠，說明miR-155的缺失抑制了頸動脈結扎誘導的內膜增生。同時，在miR-155-/-小鼠給予通心絡中劑量灌胃后，其結扎血管中的內膜增生進一步減少。
　　給通心絡中劑量灌胃的WT小鼠尾靜脈注射Ad-miR-155（于術前1天開始

14、注射，每隔7天注射一次，共注射3次），與Ad-null注射組比較，在結扎21天后的血管中miR-155上調3.5倍。在通心絡中劑量灌胃的WT小鼠中，頸動脈結扎21天后，與Ad-null注射組相比，Ad-miR-155注射組的結扎血管中I/M比值和內膜面積均顯著增加，說明miR-155過表達部分拮抗了通心絡對內膜增生的抑制作用。
　　3、 miR-155缺失抑制頸動脈結扎誘導的巨噬細胞浸潤和炎性因子TNF-α和IL-1β的表達，而m

15、iR-155過表達部分拮抗了通心絡對巨噬細胞浸潤和TNF-α表達的抑制作用
　　免疫組化結果顯示，頸動脈結扎21天后，WT小鼠的結扎血管的新生內膜中有大量巨噬細胞浸潤，而miR-155-/-小鼠的結扎血管中巨噬細胞顯著減少。給予通心絡中劑量灌胃的miR-155-/-小鼠的結扎血管中幾乎觀察不到浸潤的巨噬細胞。同時，在通心絡中劑量灌胃的WT小鼠中，與尾靜脈注射Ad-null組相比，尾靜脈注射Ad-miR-155組的結扎血管中浸潤的巨

16、噬細胞明顯增多。
　　qRT-PCR結果顯示，在頸動脈結扎后21天，miR-155-/-小鼠結扎血管中TNF-α的mRNA水平減少到WT小鼠的11％。給予通心絡中劑量灌胃的miR-155-/-小鼠的結扎血管中TNF-α的mRNA水平減少到給予通心絡灌胃的WT小鼠的20％。此外，在通心絡中劑量灌胃的WT小鼠中，與Ad-null注射組相比，Ad-miR-155注射組的結扎血管中TNF-α的mRNA水平升高了2.2倍。以上結果說明，mi

17、R-155介導了結扎血管中TNF-α的表達，而miR-155過表達拮抗了通心絡對TNF-α表達的抑制作用。免疫組化顯示，各組的TNF-α的表達水平與qRT-PCR結果一致。另外，與WT小鼠相比，miR-155-/-小鼠結扎血管中的IL-1β mRNA水平下降了50％，但給予通心絡中劑量灌胃的miR-155-/-小鼠與給予通心絡中劑量灌胃的WT小鼠組比較，IL-1β mRNA水平無明顯變化，同時，在通心絡中劑量灌胃的WT小鼠中，Ad-mi

18、R-155注射使miR-155過表達后并沒影響結扎血管中IL-1β的mRNA水平。這些結果說明，通心絡對IL-1β表達的抑制作用并不是通過調節(jié)miR-155的表達實現(xiàn)的。
　　4、在頸動脈結扎后期過表達miR-155仍可部分拮抗通心絡對內膜增生的抑制作用
　　在通心絡中劑量灌胃的WT小鼠中，于頸動脈結扎術后第14天注射Ad-miR-155，與Ad-null注射組相比，Ad-miR-155注射組結扎血管的內膜增生加重，說明在血

19、管重塑后期過表達miR-155仍可減弱通心絡對內膜增生的抑制作用。
　　小結:
　　miR-155參與頸動脈結扎誘導的新生內膜的形成過程;通心絡對頸動脈結扎誘導的內膜增生和血管炎癥應答的抑制作用在一定程度上是通過抑制miR-155的表達實現(xiàn)的。
　　第三部分通心絡通過阻斷miR-155與TNF-α之間的反饋環(huán)路抑制巨噬細胞炎癥應答
　　目的:揭示通心絡調節(jié)miR-155表達以及抑制巨噬細胞炎癥應答的分子機制。

20、r>　　方法:1用不同因素處理原代培養(yǎng)的小鼠骨髓來源巨噬細胞(BMMs)。2腺病毒感染實驗用于在BMMs中過表達miR-155。3 Westernblot檢測p-Akt和Akt1的表達。4 siRNA轉染實驗用于在BMMs中敲低Akt1。5 qRT-PCR檢測miR-155、TNF-α和IL-1β的表達水平。6 ELISA檢測BMMs培養(yǎng)基中TNF-α和IL-1β的含量。7傷口愈合實驗。8細胞粘附實驗。
　　結果:
　　1、

21、通心絡通過阻斷TNF-α和miR-155之間形成的正反饋環(huán)路而抑制巨噬細胞炎癥應答
　　qRT-PCR結果顯示，與對照組相比，TNF-α刺激使miR-155的表達水平上升2.5倍，通心絡預孵育以劑量依賴性的方式抑制TNF-α誘導的miR-155表達上調。另一方面，在對照組、IL-1β刺激組和通心絡預孵育+IL-1β刺激組之間miR-155的表達水平無明顯差異。這些結果說明，TNF-α可以促進BMMs中miR-155的表達，但IL-

22、1β對miR-155的表達無影響。與Ad-null感染組相比，Ad-miR-155感染的BMMs中TNF-α的mRNA水平升高6倍。來源于miR-155-/-小鼠的BMMs中TNF-α的mRNA水平比WT組顯著降低。與qRT-PCR結果相一致，ELISA檢測結果顯示，BMMs中過表達miR-155顯著增加培養(yǎng)基中TNF-α的含量，而miR-155-/-小鼠的BMMs培養(yǎng)基中TNF-α含量比WT組明顯下降。另一方面，miR-155過表達或

23、敲除均未影響B(tài)MMs及其培養(yǎng)基中IL-1β的表達水平。以上結果顯示，TNF-α和miR-155之間形成正反饋環(huán)路促進巨噬細胞的炎癥應答。
　　qRT-PCR和ELISA結果顯示，與單純過表達miR-155組比較，通心絡預孵育減少了過表達miR-155誘導的TNF-α的表達上調，TNF-α的mRNA水平和培養(yǎng)基中的蛋白水平分別減少到過表達miR-155組的31％和78％。同時，miR-155-/-BMMs無論給予或不給予通心絡預孵育

24、，其TNF-α的表達均處于較低水平。這些結果表明，通心絡可以阻斷TNF-α和miR-155之間形成的正反饋環(huán)路，這可能是其抑制炎癥應答發(fā)揮抗炎作用的機制之一。
　　2、通心絡通過上調Akt1抑制巨噬細胞中miR-155的表達
　　Western blot結果顯示，BMMs被TNF-α刺激10、20和40分鐘后p-Akt均輕微下調，通心絡預孵育(2 h)+TNF-α刺激組的p-Akt在三個時間點(10、20和40分鐘)均顯著上

25、調。但是，通心絡預孵育(2 h)+TNF-α刺激組的總Akt1的蛋白水平在這三個時間點也顯著上調。這些結果說明，通心絡預孵育后p-Akt水平上升是由于上調了總的Akt1蛋白表達引起的。
　　qRT-PCR結果顯示，在BMMs中敲低Akt1后，通心絡對TNF-α誘導的miR-155表達上調的抑制被消除，說明通心絡抑制BMMs中miR-155的表達是通過上調Akt1實現(xiàn)的。
　　3、miR-155缺失抑制巨噬細胞的遷移，但不影響

26、巨噬細胞的粘附
　　傷口愈合實驗結果顯示，來源于miR-155-/-小鼠的BMMs在劃痕后遷移的距離比WT小鼠的BMMs有所下降，說明miR-155缺失在一定程度上抑制了巨噬細胞的遷移。
　　細胞粘附實驗顯示，與WT組相比，miR-155-/-BMMs與內皮細胞的粘附數(shù)量沒有明顯變化，說明miR-155缺失不影響巨噬細胞的粘附。
　　小結:
　　通心絡通過阻斷TNF-α和miR-155之間形成的正反饋環(huán)路而抑制巨

27、噬細胞炎癥應答;Akt1介導通心絡對巨噬細胞中miR-155表達的抑制作用;miR-155缺失抑制巨噬細胞的遷移，但不影響巨噬細胞的粘附。
　　結論:
　　1、通心絡抑制頸動脈結扎誘導的內膜增生。
　　2、通心絡通過抑制炎性因子的表達和巨噬細胞的浸潤而減輕血管炎癥反應。
　　3、 miR-155缺失抑制頸動脈結扎誘導的內膜增生;通心絡對內膜增生的抑制作用是通過抑制miR-155的表達實現(xiàn)的。
　　4、 TN