診治法布萊氏病的單抗及重組蛋白的研制.pdf

1、法布萊氏病是一種X連鎖隱性遺傳病，由定位于Xq22的α-半乳糖苷酶A(alpha-galactosidaseA，α-GalA)基因突變使酶失活造成。研究表明，人體內α一半乳糖苷酶的先天性缺乏而致使其底物N-脂酰鞘氨醇己三糖苷在全身細胞、組織和器官中累積而引起血液循環(huán)障礙并進一步導致心、腎功能衰竭和神經(jīng)系統(tǒng)紊亂而死亡。法布萊氏病在男性中發(fā)病率為1/40000，而且在早期一般很難診斷。若不能及時診斷治療，患者一般在40歲左右就會死于心、腎功

2、能衰竭和神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，女性發(fā)病時間稍晚，一般在40-50歲發(fā)病。法布萊氏病的早期診斷治療對阻止病情發(fā)展，改善病人生存質量，延長病人生存時間具有重要意義。 利用α-半乳糖苷酶A單抗檢測患者體內的α半乳糖苷酶A蛋白水平是法布萊氏病早期診斷的可靠方法。為了獲得效價高的、特異性強的抗人α-半乳糖苷酶A單克隆抗體，本文使用計算機軟件分析α-半乳糖苷酶A的優(yōu)勢抗原表位，合成2個具有強抗原性的多肽并與載體蛋白KLH偶聯(lián)，免疫小鼠，采用甲基纖維

3、素半固體培養(yǎng)基篩選雜交瘤細胞株。使用酶聯(lián)免疫、SDS-PAGE、Western-Blot和染色體核型分析等方法對雜交瘤細胞及其產生的單抗進行鑒定。篩選到1株穩(wěn)定表達α半乳糖苷酶A單抗雜交瘤細胞株。制備的單抗屬IgG1亞型，能夠特異性地與人α-半乳糖苷酶A反應，并展示出很強的親和力。采用酶聯(lián)免疫方法用獲得的單克隆抗體檢測12例正常人及5例法布萊氏病患者血漿中的α-半乳糖苷酶A。結果患者組的OD<,450>吸光度平均值為0.159±0.06

4、3(最大0.238，最小0.080)，低于正常組的平均吸光度值0.481±0.116(最大0.694，最小0.332)。同時酶活性檢測血漿中α-半乳糖苷酶活性，患者組的吸光度平均值為0.015±0.008(最大0.024，最小0.004)，低于正常組的吸光度平均值0.032±0.006(最大0.044，最小0.022)。但是在抗體檢測的結果中一例患者的OD<,450>吸光度值接近正常人的，這是因為有的病人α半乳糖苷酶A蛋白有較高的表達水

5、平，卻無水解活性。將單抗檢測與酶活性檢測相結合，可以增加了斷的可靠性，為進一步研究法布萊氏病的診斷奠定了基礎。 向病人體內注射α-半乳糖苷酶A的酶替代療法是目前治療法布萊氏病最有效的方法，但如何獲得足量、高純度的α-半乳糖苷酶A是使用酶替代療法的前提。本文的另一個目的是克隆人α-半乳糖苷酶A(α-GalA)cDNA，并在畢赤酵母中表達重組的人α-GalA。利用RT-PCR方法從人肝癌細胞中克隆人伐．半乳糖苷酶A cDNA，測序結

6、果說明獲得的序列與文獻報道一致。將α-半乳糖苷酶A cDNA構建到可用甲醇誘導的分泌型畢赤酵母表達載體pPICZαA。重組載體導入畢赤酵母后使用Zeion抗生素篩選轉化細胞。在甲醇誘導后，使用SDS-PAGE、Western印跡及酶活測定方法檢測酵母上清中人α-GalA。我SDS-PAGE結果表明在酵母培養(yǎng)上清中有大約46KD的條帶，與預期的α-GalA的大小一致，該條帶能夠特異的與抗α-GalA單抗結合。進一步研究表明培養(yǎng)上清中有α-