姜黃素對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用.pdf

1、帕金森病(parkinson’s disease，PD)是繼阿爾茨海默病之后的第二大神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。我國(guó)目前擁有170萬(wàn)-200萬(wàn)帕金森病患者，65歲以上人群帕金森發(fā)病率已高達(dá)1.7％。隨著我國(guó)社會(huì)老齡化趨勢(shì)的不斷發(fā)展，PD對(duì)患者和社會(huì)的負(fù)擔(dān)將越來越重。 PD的主要病理學(xué)特征是黑質(zhì)(substantia nigra, SND區(qū)多巴胺(Dopamine，DA)能神經(jīng)元的漸進(jìn)性死亡及伴發(fā)的紋狀體(striatum，Str)軸突末梢DA的

2、耗竭。目前PD的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但可能與遺傳因素、環(huán)境因素、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子缺失等多種因素的共同參與有關(guān)。到目前為止對(duì)PD沒有行之有效的治療辦法，在臨床上也只能對(duì)癥治療。因此，深入探討PD的發(fā)病機(jī)制并研制出針對(duì)PD病因有效的藥物成為醫(yī)學(xué)界迫在眉睫的話題。 天然的黃酮類化合物具有多種生物學(xué)活性，已經(jīng)被人們廣泛地應(yīng)用于神經(jīng)退行性疾病的防治研究中。姜黃素( curcumin)是一種從姜黃根中提取的植物多酚，在不同的組

3、織中都被證實(shí)了其具有極強(qiáng)的清除自由基、螯合金屬離子和抗炎的作用。本實(shí)驗(yàn)的目的在于進(jìn)一步探討姜黃素對(duì)PD的防治作用及對(duì)DA能神經(jīng)元保護(hù)作用的可能機(jī)制。首先制備了(6-hydroxydopamine，6-OHDA)誘導(dǎo)的PD大鼠模型，應(yīng)用高效液相電化學(xué)檢測(cè)(HPLC-ECD)法，觀察了6-OHDA處理后，大鼠Str的DA及其代謝產(chǎn)物二羥基苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)的含量變化；應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法，觀察了大鼠SN區(qū)酪氨酸羥化酶

4、(TH)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目表達(dá)的變化；同時(shí)運(yùn)用了鐵染色的方法，觀察了大鼠SN區(qū)鐵染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目表達(dá)的變化，又分別運(yùn)用了以上的技術(shù)方法觀察了姜黃素對(duì)這些改變的影響。在6-OHDA誘導(dǎo)的PD細(xì)胞模型，應(yīng)用甲基噻（）基四（）(methyl thiazolyltetrazolium，MTT)，觀察了細(xì)胞的存活率；應(yīng)用流式儀細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)，觀察了細(xì)胞線粒體跨膜電位差（mitochondrial transmembra

5、ne potential，ΔΨm）和活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平的變化；運(yùn)用Westem blots的方法，分別觀察了超氧化物歧化酶( Superoxide dismutase，SOD)和核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor-kappaB，NF-KB)蛋白水平的變化，同時(shí)運(yùn)用以上的技術(shù)方法觀察了姜黃素對(duì)這些改變的影響。結(jié)果如下： 1.與對(duì)照組相比，6-OHDA損傷大鼠后，Str的DA及

6、DOPAC的含量明顯降低(P<0.05)，HVA的含量沒有明顯改變(P>0.05)。而姜黃素預(yù)處理組的DA及其代謝產(chǎn)物的含量與6-OHDA組相比，明顯升高(P<0.05)。 2.6-OHDA損傷的大鼠SN區(qū)，TH免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少，與對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.01)，而經(jīng)姜黃素預(yù)處理后，TH免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多，與6-OHDA組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 3.6-OHDA損傷的大鼠SN區(qū)，鐵染色陽(yáng)性細(xì)

7、胞數(shù)較對(duì)照組顯著增多(P<0.01)，而姜黃素處理后，可以有效地抑制6-OHDA的這一效應(yīng)。 4.MIT法檢測(cè)DA能細(xì)胞株MES23.5細(xì)胞存活率的結(jié)果顯示：6-OHDA處理MES23.5細(xì)胞24h，細(xì)胞存活率隨6-OHDA濃度增加而逐漸降低。給予25μmol/L和50μmol/L濃度的6-OHDA時(shí)，與對(duì)照組比較，細(xì)胞存活率下降了13％和12％；給予100μmol/L and150μmoyL濃度的6-OHDA時(shí)，與對(duì)照組比較，

8、細(xì)胞存活率分別下降了44％ and65％，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。單獨(dú)用姜黃素處理MES23.5細(xì)胞24h，當(dāng)給予姜黃素的濃度大于15μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比有顯著降低(P<0.01)。 5.MTT法檢測(cè)DA能細(xì)胞株MES23.5細(xì)胞存活率的結(jié)果顯示：經(jīng)10μmol/L的姜黃素預(yù)處理后，6-OHDA損傷的MES23.5細(xì)胞的存活率與單純6-OHDA損傷組相比明顯提高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

9、 6.FCM檢測(cè)ΔΨm發(fā)現(xiàn)，MES23.5細(xì)胞經(jīng)100μmol/L的6-OHDA孵育24 h后，MES23.5細(xì)胞的ΔΨm較對(duì)照組相比明顯降低，經(jīng)10μmol/L的姜黃素預(yù)處理后，可以抑制由6-OHDA造成的細(xì)胞ΔΨm的降低，與單純6-OHDA組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 7.FCM檢測(cè)ROS發(fā)現(xiàn)，MES23.5細(xì)胞經(jīng)100μmol/L的6-OHDA孵育24 h后，MES23.5細(xì)胞內(nèi)ROS的水平較對(duì)照組相比明

10、顯升高，經(jīng)10μmol/L的姜黃素預(yù)處理后，可以抑制由6-OHDA造成的細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高，與單純6-OHDA組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 8.100μmol/L6-OHDA處理MES23.5細(xì)胞24h后，Cu/Zn-SOD的蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組相比明顯降低，經(jīng)10μmol/L的姜黃素預(yù)處理后，Cu/Zn-SOD蛋白表達(dá)水平與單純6-OHDA組相比明顯升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 9.100

11、μmol/L6-OHDA處理MES23.5細(xì)胞24h，位于核內(nèi)的NF-кB蛋白表達(dá)水平明顯升高，經(jīng)10μmol/L的姜黃素預(yù)處理后，可以抑制NF-кB由胞漿向核內(nèi)的移位，與單純6-OHDA組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 上述結(jié)果表明：在體實(shí)驗(yàn)中，姜黃素對(duì)6-OHDA損傷的大鼠黑質(zhì)DA能神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用，姜黃素可以減少黑質(zhì)中DA能神經(jīng)元的脫失，增加紋狀體中DA及其代謝產(chǎn)物的含量以及降低DA的代謝率。姜黃素的這種保護(hù)