通過RNA-seq初步考察銅綠假單胞菌噬菌體PaP3對宿主轉錄組的全局性調控作用.pdf

1、銅綠假單胞菌是一種革蘭氏陰性菌,屬于假單胞菌科,普遍存在于水和土壤中,為典型的人類條件致病菌,其感染可發(fā)生于呼吸道,尿道,燒傷和創(chuàng)傷等[1]。由于對多種抗生素都具有抵抗力,銅綠假單胞菌成為重要的醫(yī)院內病原菌[2]。銅綠假單胞菌不僅含有自己的藥物抗性基因,還能從其他細菌獲取抗性基因[3]。多年來,已有大量研究致力于闡明銅綠假單胞菌的致病性和耐藥性,自基因組測序技術開始,這些研究逐步從傳統(tǒng)的以單一細菌毒力決定簇為核心的致病性研究轉向大規(guī)模的

2、全基因組分析。
　　標準株PAO1是第一株被測序的銅綠假單胞菌,最顯著的特征是其基因組為細菌中最大的基因組之一,包含了6260,000個堿基對和90％的蛋白編碼基因,此外還含有與酵母菌細胞相當?shù)?570個開放閱讀框。這種基因組的復雜性正是銅綠假單胞菌在各種復雜環(huán)境下生存繁殖并對耐受多種抗生素的原因所在[4]。PA3是由本科室從燒傷科分離得到的一株銅綠假單胞菌,其基因組的特征與PAO1相似。RNA-seq技術使我們能夠動態(tài)地觀測銅綠

3、假單胞菌的基因組對各種刺激的反應。從而我們能可以進一步分析研究多個野生株和銅綠假單胞菌的臨床分離株的基因組特征及存在于不同的菌株之間的核心基因成分,并且還能弄清那些在特殊環(huán)境下對細菌的生存具有促進作用的基因,而這些基因的表達都是由轉錄調控子介導的轉錄所控制的。并且PAO1有10%的基因組屬于轉錄調控子,這再一次提示銅綠假單胞菌的基因表達是在轉錄調控子的緊密調控下完成的。
　　噬菌體作為一種寄生生物,與宿主菌共存,能利用宿主菌的大分

4、子合成裝置進行復制,這一過程涉及了眾多調控機制[5]。噬菌體需要在轉錄水平上控制宿主菌的多個轉錄調控子,使有利于噬菌體復制的基因表達,其他無關的基因則被抑制[6]。本課題通過基于Illumina高通量測序平臺的RNA-seq技術對來源于銅綠假單胞菌噬菌體PaP3感染宿主菌PA3后五個時間點的總轉錄本進行了序列測定,通過生物信息學分析鑒定出差異表達基因并對其進行了GO功能及KEGGPathway顯著富集性分析,同時對新轉錄本,非翻譯區(qū)(U

5、ntranslatedRegions,UTRs),啟動子和非編碼小RNA(sRNA)進行了檢測及初步分析,全面快速地獲取了銅綠假單胞菌噬菌體PaP3對其宿主菌PA3轉錄組全局性調控的基本信息。本研究的主要內容及結果包括以下幾個方面:
　　1.銅綠假單胞菌PA3被噬菌體PaP3感染后的轉錄組測序評估:測序所得的Reads能夠比對到參考基因組和參考基因序列的平均比例分別為94.09%和61.25%;通過減法雜交的rRNA平均去除率高達

6、99.6%,去除雜質后的cleanreads比對到參考基因組和參考基因上的比例符合覆蓋整個基因組和轉錄組的要求?；蚋采w度在70%-100%的Reads平均為4298條,占所有測序基因的80%。RNA打斷的隨機性好,Reads在基因的各個部位分布比較均勻,所測數(shù)據(jù)符合后續(xù)基因表達注釋的標準。
　　2.銅綠假單胞菌PA3被噬菌體PaP3感染后的基因動態(tài)表達分析:根據(jù)RPKM表達量算法共得到5536個差異表達基因,其中5466個為PA

7、3的基因,70個為PaP3的基因。PA3的差異表達基因歸屬于27條PseudoCAP功能注釋,KEGGPathway顯著性富集分析涉及了31條代謝路徑。分析發(fā)現(xiàn),被PaP3感染后PA3中87.5%的σ因子、81.5%的必需基因和86.5%的核心基因出現(xiàn)差異表達。PA3的差異基因中有4174個基因下調表達,這些下調基因絕大多數(shù)受細菌全局性調控系統(tǒng)調節(jié)。利用VFBD數(shù)據(jù)庫比對顯示,76.5%已注釋毒力相關基因下調表達?？梢?噬菌體PaP3可

8、能通過抑制宿主菌PA3轉錄調節(jié)相關基因而對宿主的轉錄組進行全局性的調控。
　　3.銅綠假單胞菌PA3的轉錄組結構及5'非翻譯區(qū)(5'UTRs)分析:我們分別對PA3被噬菌體感染后不同時間點的六個樣本的轉錄本(TUs)進行了TSS檢測,所檢測的TUs、SD序列以及Rho-independent終止子數(shù)目在各樣本中基本一致,每個樣本平均檢測到3570個TUs、1834個SD序列和322個終止子。確定了TUs的5’端以及其下游基因的5’

9、UTR,統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)50%5’UTR以上的長度都集中在200nt以下的范圍。PA3被PaP3感染的不同時期,所測的5’UTR總量基本沒有變化。而在長度分布上,200nt以下的5’UTRs變化顯著。我們推測,在PA3中發(fā)揮調控作用的主要是長度在200nt以下的5’UTRs,PaP3可能會作用于這些小于200nt的5’UTR而調控宿主的基因轉錄。
　　4.銅綠假單胞菌PA3被噬菌體PaP3感染后的sRNA表達的研究:銅綠假單胞菌中已注釋的

10、19種sRNA在本研究中均出現(xiàn)了差異表達。有9種在五個時間點中均下調表達,僅P18和P34在整個過程表達上調。除上述已注釋的sRNA基因外,我們還檢測出1329個新的候選sRNA,統(tǒng)計出其中有意義的差異表達的候選sRNA91種:50種上調,41種下調。提示這些sRNA可能與噬菌體的感染及細菌的抵抗有關,但需進一步的實驗驗證及深入的功能分析。
　　綜上所述,利用直接的高通量cDNAs測序方法(RNA-seq)分析發(fā)現(xiàn),銅綠假單胞菌噬