NF-κB在孕鼠深靜脈血栓血管內皮細胞中的表達及其抑制劑的干預作用.pdf

1、[研究背景與目的]
　　 深靜脈血栓(deepveinthrombosis，DVT)是一種常見的血管血栓性疾病，DVT的急性期容易導致肺栓塞，存在致死性，越來越受到國內外學者的重視。英國學者統(tǒng)計妊娠期DVT發(fā)病率為0.05％～0.10％，近年來妊娠期和產褥期深靜脈血栓的發(fā)病率呈上升趨勢。妊娠期由于生理性獲得性易栓因素的存在和血液高凝狀態(tài)是導致其發(fā)病率增高的重要原因。目前公認Virchow提出血流滯緩、血液高凝、靜脈壁的損傷是靜脈

2、血栓形成的三大因素。近年來研究發(fā)現炎癥與深靜脈血栓的形成和發(fā)展有著密切關系，炎癥反應介導血管內皮細胞損傷，血流淤滯，從而促進靜脈血栓形成;血栓的形成加劇炎癥反應，兩者相互影響。已有大量的病理學和血清炎癥與靜脈血栓的相互關系提供有力的依據。因此研究靜脈血栓發(fā)生、發(fā)展相關的調控炎癥因子的蛋白對于延緩、減輕靜脈血栓形成及預后的判斷具有重要的意義。
　　 核轉錄因子(nuclearfactor-kappaB，NF-κB)是由Sen和Ba

3、ltimore發(fā)現以能與B細胞免疫球蛋白κ輕鏈基因的增強子κB序列（GGGACTTTCC）特異結合而命名。NF-κB是近年來發(fā)現重要的轉錄因子，是細胞中普遍存在的具有多向轉錄調節(jié)作用的序列特異性DNA結合蛋白。NF-κB通常與抑制蛋白(IκB)結合成三聚體，以失活狀態(tài)存在于細胞漿中，當細胞受到各種刺激原如紫外輻射、細胞因子、活性氧作用時，NF-κB與IκB解離并進入細胞核結合靶基因啟動子以激動相應基因的轉錄。目前已在淋巴細胞激活、敗血癥

4、、急性炎癥反應綜合征(AIRS)、肝臟缺血再灌注損傷、腫瘤血管新生方面等疾病中發(fā)現NF-κB蛋白的作用。
　　 越來越多研究表明在炎癥反應復雜的細胞因子網絡中，NF-κB的激活可能是一個中心環(huán)節(jié)。NF-κB在炎癥細胞激活的信號調控中起著重要作用，通過活化中性粒細胞、內皮細胞，使細胞釋放一系列粘附分子、細胞因子、酶類等介質，介導或直接參與白細胞和血管內皮細胞的相互作用以及組織的損傷。NF-κB控制著炎癥及免疫相關基因的表達，這些基

5、因涉及到中毒性休克、急性期反應、輻射損傷、哮喘、風濕性關節(jié)炎、動脈粥樣硬化、癌癥等多種疾病過程，因此可以通過抑制NF-κB轉錄活性來治療這些疾病。吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(PDTC)作為NF-κB特異性的抑制劑，理論上可減少NF-κB的核移位進而抑制NF-κB的活化?；谶@種思路，探討NF-κB在靜脈血栓發(fā)生發(fā)展階段中表達的量化特點及變化規(guī)律的研究，是否可通過抑制其活性及相應細胞因子的分泌，改善炎癥反應，從而影響血栓的形成。探討NF-κB

6、激活的信號通路能否作為新型藥物靶點的研究方向，為防治深靜脈血栓提供初步的理論依據。
　　 因此，本實驗采用下腔靜脈結扎法建立孕鼠深靜脈血栓模型，進一步從量化水平探討深靜脈血栓形成后血管內皮細胞中NF-κB蛋白的表達特點，初步分析NF-κB蛋白與深靜脈血栓發(fā)生發(fā)展的關系;分析NF-κB蛋白的表達水平與血栓形成情況的相關關系。本實驗使用NF-κB的抑制劑PDTC干預孕鼠，再探討其干預作用對NF-κB蛋白的表達及形成血栓的大小有何影響

7、。
　　 [材料與方法]
　　 1、54只SD大鼠購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心，常規(guī)飼養(yǎng)一周后，以2:1雌性與雄性SD大鼠合籠，各組大鼠孕10-15天行DVT造模，其中48只隨機分為血栓模型組、PDTC干預組，根據6h、12h、24h、72h時間點隨機分為四個亞組，各點為6只，其余6只為假手術組。
　　 2、采用下腔靜脈結扎法建立孕鼠深靜脈血栓模型，血栓模型組和PDTC干預組在造模前1h分別給予腹腔注射0.9％生

8、理鹽水和PDTC(100mg/kg/d)，每24h注射1次，72h即注射3次。
　　 3、分別在建模后規(guī)定的各時間點分批處死動物，稱取形成血栓的濕重和測量其長度，比較兩組血栓形成情況。靜脈血栓組織放至10％中性福爾馬林液中固定以備HE染色和免疫組化檢測。
　　 4、HE染色后，在光鏡下觀察各組下腔靜脈血栓病理形態(tài)學改變和炎癥細胞的表達，采用免疫組化半定量圖像分析法檢測各組DVT血管內皮細胞中NF-κB蛋白的表達水平，用I

9、mageproplus圖像分析技術測量NF-κB蛋白的陽性單位（Meanopticaldensity，IOD），分析不同時間點組織中NF-κB蛋白表達強度的特點及與DVT之間的關系，分析各組血栓形成情況與NF-κB蛋白表達的相關關系。
　　 5、統(tǒng)計學分析:所得的數據用SPSS13.0軟件進行處理，各組數據均以平均值±標準差(-X±s)表示。采用析因設計的方差分析各組間血栓濕重與長度比值及NF-κBIOD值，同一時間點兩組間的比

10、較采用獨立樣本的t檢驗，分析各組及組間差異是否有統(tǒng)計學意義。組間相關性分析采用雙變量相關分析，服從雙變量正態(tài)分布資料選擇Pearson相關系數。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 [結果]
　　 一、孕鼠深靜脈血栓模型的建立及檢測
　　 1、利用結扎法結扎下腔靜脈和及其兩側髂腰支，可成功的構建孕鼠深靜脈血栓模型。
　　 2、建模后各時間點均可見明顯的下腔靜脈血栓的形成，術后可見形成的紅色血栓或混合

11、血栓，血栓質地松軟，靜脈壁柔軟，尚富有彈性，擠壓血栓塊可從血管壁脫出，靜脈壁與周圍組織無明顯粘連。術后72h形成層狀血栓，血栓質地較硬，靜脈壁較韌，靜脈壁與周圍組織粘連緊密。隨著時間延長，形成血栓濕重與血栓長度比值增加。
　　 3、HE染色光鏡下觀察術后6h、12h可見形成的紅色血栓為主，24h形成的混合血栓為主，72h可見層狀血栓的形成，靜脈血栓血管壁周圍伴隨著炎癥細胞增多，明顯炎癥反應，炎癥細胞以24h、72h明顯增多。

12、r>　　 二、深靜脈血栓血管內皮細胞中NF-κB蛋白表達的定量分析
　　 1、正常孕鼠血管內皮細胞中NF-κB表達弱，NF-κB蛋白的IOD值以DVT形成后6h開始升高，24h達高峰，72h后下降。
　　 2、NF-κBp65蛋白的IOD值(0.72+0.23)在血栓血管內皮細胞中與正常血管內皮細胞(0.12+0.04)中的表達差異有統(tǒng)計學意義（t=-6.379，P=0.000）。
　　 三、PDTC干預DVT

13、后形成的血栓濕重與血栓長度的比值情況
　　 血栓模型組形成的血栓濕重與長度比值顯著高于PDTC干預組（F=5.755，P=0.021），PDTC藥物干預后不同時間點形成血栓濕重與血栓長度比值有顯著差異(F=4.394，P=0.009)。PDTC干預72h后血栓濕重與血栓長度比值顯著低于血栓模型組(P=0.047)，而在6h、12h、24h時間點中血栓濕重與長度比值相比無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 四、PDTC干預

14、DVT后血管內皮細胞中NF-κBp65的表達情況
　　 1、PDTC干預組靜脈血管內皮細胞中NF-κB平均光密度值均明顯低于血栓模型組(F=17.276，P=0.000)，PDTC干預后不同時間點NF-κB平均光密度值有顯著性差異(F=15.685，P=0.000)。
　　 2、應用PDTC干預后NF-κB蛋白的表達水平較血栓模型組下降，但以PDTC干預12h(P=0.046)、24h(P=0.044)、72h(P=0.

15、016)后NF-κBp65平均光密度值明顯低于血栓模型組，差異有統(tǒng)計學意義。
　　 五、深靜脈血栓血管內皮細胞中NF-κB蛋白與血栓大小的相關性分析
　　 正常靜脈內皮細胞、血栓模型組和PDTC干預組相比較，三者中NF-κB蛋白表達的強度差異有統(tǒng)計學意義(F=28.704，P=0.000);深靜脈血栓血管內皮細胞中NF-κB蛋白的表達水平與血栓濕重/長度比值大小呈正相關(r=0.392，P=0.006)。
　　

16、[結論]
　　 一、應用下腔靜脈結扎法成功的構建了孕鼠深靜脈血栓模型，并于6h、12h、24h、72h觀察到不同時間段的血栓形成和靜脈血管壁周圍的炎癥反應，表明炎癥參與靜脈血栓的發(fā)生發(fā)展。
　　 二、NF-κB蛋白在正常靜脈內皮細胞中低表達，在血栓血管內皮細胞中表達明顯增強，提示深靜脈血栓形成后NF-κB蛋白明顯激活。NF-κB的抑制劑PDTC干預DVT后NF-κB蛋白的表達水平明顯下降，炎癥反應減輕。
　　 三