Niban在腎間質(zhì)纖維化中的研究.pdf

1、第一章腎間質(zhì)纖維化差異蛋白的篩選
　　研究背景:腎間質(zhì)纖維化(Renal Interstitial Fibrosis，RIF)以腎小管擴(kuò)張和間質(zhì)纖維化為特征。研究認(rèn)為，RIF的程度預(yù)示著腎功能受損的程度，與病人腎臟疾病的預(yù)后密切相關(guān)。RIF是各種慢性腎臟病(Chronic Kidney Disease，CKD)向終末期進(jìn)展過(guò)程中的一種共同病理表現(xiàn)。研究RIF的作用機(jī)制，尋找RIF的生物標(biāo)志物，探索防治RIF的有效措施，對(duì)于延緩慢性

2、腎臟疾病的進(jìn)程意義重大，是目前全球腎病研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展受多方面因素的影響，腎小管上皮細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、成纖維細(xì)胞增殖與活化、腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、細(xì)胞因子及血管活性物質(zhì)的產(chǎn)生、細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解失衡等均參與其過(guò)程。鑒于腎間質(zhì)纖維化機(jī)制的復(fù)雜性，我們認(rèn)為目前已有的研究結(jié)果并不能完全解釋腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病過(guò)程，應(yīng)該還存在尚未引起重視的、可以影響腎間質(zhì)纖維化過(guò)程的新蛋白、新機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)聯(lián)合蛋白質(zhì)組

3、學(xué)及基因芯片研究的方法，對(duì)腎間質(zhì)纖維化經(jīng)典模型——單側(cè)輸尿管梗阻(UnilateralUreteral Obstruction，UUO)大鼠腎組織中的差異蛋白進(jìn)行篩選，尋找腎間質(zhì)纖維化過(guò)程的生物標(biāo)志物。
　　目的:在3天、7天、14天、21天UUO大鼠腎組織中，以蛋白質(zhì)組學(xué)聯(lián)合基因芯片的分析方法，篩選腎間質(zhì)纖維化過(guò)程中有意義的差異蛋白。
　　方法:建立腎間質(zhì)纖維化UUO大鼠模型。SD大鼠（25只）隨機(jī)分為假手術(shù)組、3天、7天

4、、14天、21天UUO模型組（每組5只）;于UUO術(shù)后3、7、14、21天留取各組大鼠梗阻側(cè)腎臟標(biāo)本，行HE染色觀察大鼠腎間質(zhì)纖維化程度。MASSON染色、Ⅲ型膠原免疫組化橫斷面觀察14天UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化成模情況。同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation,iTRAQ)技術(shù)篩選3天、7天、14天、21天UUO大鼠腎組織差異蛋白表達(dá)譜，并與基因芯

5、片的結(jié)果進(jìn)行配對(duì)分析，尋找腎間質(zhì)纖維化過(guò)程中有意義的差異蛋白。
　　結(jié)果:(1) HE染色結(jié)果提示UUO模型成功，3天、7天、14天、21天UUO大鼠腎組織按時(shí)間呈現(xiàn)不同程度的腎小管擴(kuò)張及間質(zhì)纖維化。14天UUO組大鼠腎臟的腎間質(zhì)損傷指數(shù)、細(xì)胞外基質(zhì)以及Ⅲ型膠原表達(dá)量均比假手術(shù)組明顯升高(p＜0.05)。
　　(2)鑒于我們主要著眼于尋找腎間質(zhì)纖維化早中期的生物標(biāo)志物，我們以iTRAQ聯(lián)合基因芯片篩選3天、7天、14天UUO

6、大鼠腎組織中有意義的差異蛋白。與假手術(shù)組比較，UUO術(shù)后3天、7天、14天四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，差異蛋白持續(xù)上/下調(diào)（蛋白表達(dá)改變＞1.2 or＜0.8），且滿(mǎn)足相對(duì)應(yīng)的基因表達(dá)＞2.0 or＜0.5的蛋白，共15個(gè);其中持續(xù)上調(diào)的差異蛋白共9個(gè);持續(xù)下調(diào)的差異蛋白共6個(gè)（包括Niban）。
　　(3) Niban與腎間質(zhì)纖維化的關(guān)系尚不明確，故確定Niban為本研究組后續(xù)研究的目標(biāo)蛋白，重點(diǎn)研究Niban在腎間質(zhì)纖維化中的表達(dá)及可能的作用

7、機(jī)制。
　　第二章 Niban在腎間質(zhì)纖維化中的表達(dá)
　　研究背景:Niban是2000年由Majima首次發(fā)現(xiàn)的蛋白，主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。Niban最早在Eker大鼠（一種遺傳性腎臟腫瘤的大鼠模型）中發(fā)現(xiàn)。在人和動(dòng)物的其他腎臟腫瘤、患者頭頸部鱗癌、頭頸部發(fā)育不良組織、酗酒/嗜煙及甲狀腺損傷患者粘膜上皮組織中，Niban均表達(dá)升高。Niban可能作為一種早期腫瘤標(biāo)志物，對(duì)細(xì)胞起促進(jìn)增殖、抑制凋亡的作用?；诒狙芯拷M前期實(shí)驗(yàn)中

8、Niban在蛋白質(zhì)組學(xué)及基因芯片中的結(jié)果，本章節(jié)擬對(duì)Niban與腎間質(zhì)纖維化的關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證。
　　目的:通過(guò)病人、動(dòng)物及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步以體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)對(duì)腎間質(zhì)纖維化中Niban蛋白及mRNA表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。
　　方法:免疫組織化學(xué)法對(duì)梗阻性腎病患者腎組織中Niban蛋白表達(dá)進(jìn)行定位及半定量檢測(cè);免疫組織化學(xué)法、Westem Blot法對(duì)UUO大鼠腎組織中Niban蛋白表達(dá)進(jìn)行定位及半定量檢測(cè);Real time-PCR檢測(cè)Nib

9、an mRNA的表達(dá)。以TGF-β1(10ng/ml)孵育HK-2細(xì)胞48小時(shí)，誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡，構(gòu)建體外腎間質(zhì)纖維化模型。Western Blot法檢測(cè)TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中Niban、FN的表達(dá)，進(jìn)一步在體外實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證腎間質(zhì)纖維化時(shí)Niban的表達(dá)情況，F(xiàn)N評(píng)估HK-2細(xì)胞纖維化狀態(tài)。
　　結(jié)果:1）梗阻性腎病患者腎組織中Niban表達(dá)較正常對(duì)照組明顯減少;
　　2）UUO大鼠腎組織中Niban蛋白表達(dá)較假

10、手術(shù)組明顯減少;而UUO大鼠腎組織中Niban mRNA表達(dá)較假手術(shù)組升高;
　　3）TGF-β1孵育HK-2細(xì)胞48小時(shí)后，F(xiàn)N表達(dá)升高，Niban表達(dá)減少。
　　結(jié)論:1）Niban在UUO大鼠及梗阻性腎病患者腎組織中表達(dá)減少;
　　2）Niban在TGF-β1誘導(dǎo)的體外腎間質(zhì)纖維化模型（HK-2）中表達(dá)減少。
　　第三章 Niban在腎間質(zhì)纖維化中的作用機(jī)制探討
　　研究背景:腎間質(zhì)纖維化以腎小管擴(kuò)張

11、和間質(zhì)纖維化為特征，與慢性腎臟病的進(jìn)展密切相關(guān)。腎間質(zhì)纖維化的程度預(yù)示著腎功能受損的程度，與患者腎臟疾病的預(yù)后關(guān)系密切。腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制復(fù)雜，涉及到多個(gè)步驟及環(huán)節(jié)，腎小管上皮細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)分化、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、炎癥、氧化應(yīng)激、多種細(xì)胞因子及血管活性物質(zhì)產(chǎn)生等均參與腎間質(zhì)纖維化的過(guò)程。其中，凋亡在誘發(fā)腎小管上皮細(xì)胞萎縮及腎間質(zhì)纖維化形成中起重要作用。
　　凋亡(Apoptosis)也稱(chēng)為“程序性細(xì)胞死亡”或“細(xì)胞自殺”，是一種遺傳

12、控制的生理性死亡。在正常情況下，凋亡起消除老化細(xì)胞或未參與免疫反應(yīng)的淋巴細(xì)胞的作用;而發(fā)生病理性改變時(shí)，凋亡則可以對(duì)腫瘤生成在內(nèi)的多種病理情況起作用。時(shí)至今日，已經(jīng)在多種腎病模型和臨床患者腎臟病理檢測(cè)中，觀察到了腎小管上皮細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象。
　　Niban的相關(guān)研究顯示，它是一種功能蛋白。Niban可以通過(guò)影響真核轉(zhuǎn)錄起始因子——eIF2α及S6K1/4E-BP1磷酸化，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡信號(hào);Niban還通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性拮抗MDM2

13、（AKT通路下游的一個(gè)作用底物），導(dǎo)致P53降解增多，發(fā)揮抑制凋亡的作用。Niban在腎纖維化領(lǐng)域的作用研究，尚不明確?；贜iban對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，以及上一章我們對(duì)Niban在腎間質(zhì)纖維化中表達(dá)的驗(yàn)證，本章節(jié)擬對(duì)Niban在腎小管上皮細(xì)胞凋亡中的作用進(jìn)行觀察，以探討Niban在腎間質(zhì)纖維化中的可能作用機(jī)制。
　　目的:觀察UUO大鼠腎組織及TGF-β1(10ng/ml)孵育48小時(shí)后腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)凋亡情況;

14、觀察Niban表達(dá)量改變（沉默或過(guò)表達(dá)）時(shí)，對(duì)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響。
　　方法:TUNEL法檢測(cè)UUO大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況;TUNEL法及流式細(xì)胞儀檢測(cè)TGF-β1孵育48小時(shí)后HK-2細(xì)胞凋亡情況;TUNEL法及流式細(xì)胞儀檢測(cè)siRNA沉默Niban后HK-2細(xì)胞凋亡情況;Western Blot法對(duì)siRNA沉默Niban的效果進(jìn)行檢測(cè);流式細(xì)胞儀檢測(cè)Niban質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后HK-2細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果:1）與

15、假手術(shù)組相比，UUO組大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡明顯增加;
　　2）與對(duì)照組相比，TGF-β1孵育后HK-2細(xì)胞凋亡明顯增多;
　　3) siRNA沉默Niban后，HK-2細(xì)胞凋亡增加，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;
　　4）Niban質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HK-2細(xì)胞，TGF-β1干預(yù)后細(xì)胞凋亡未見(jiàn)減少。
　　結(jié)論:1）腎間質(zhì)纖維化時(shí)，腎小管上皮細(xì)胞凋亡增加，Niban表達(dá)減少，兩者趨勢(shì)相反;
　　2）沉默Niban的