組織醛固酮在腎間質纖維化過程中作用的實驗研究.pdf

1、研究背景 腎間質纖維化的慢性進展目前尚無有效控制措施。因此，尋找腎間質纖維化致病因子以及針對其發(fā)病機制的研究方興未艾。醛固酮(aldosteroneALDO)作為調節(jié)機體水鹽代謝平衡的一種內分泌激素已為人熟知。近年來，醛固酮與臟器纖維化的研究又取得了突破性進展。研究證實，醛固酮可以作為獨立致病因子促進心臟和血管纖維化的發(fā)生和發(fā)展；此外，腦組織、心臟、血管內皮細胞等腎上腺外組織也證實具有合成醛固酮的能力，這種局部產生的醛固酮被命名

2、為組織醛固酮(localaldosterone)。目前，醛固酮致臟器纖維化的發(fā)病機制已成為多學科的研究熱點，同時，分子生物學研究方法的進步使疾病發(fā)生過程中細胞信號轉導特征受到普遍關注。迄今為止，對醛固酮在腎間質纖維化的過程中的致病機制及該病理機制的信號轉導途徑尚知之甚少。擬利用體外細胞生物學實驗對上述問題進行深入研究。 研究目的一.觀察腎小管上皮細胞系(HKC)是否具有合成組織醛固酮的能力并觀察內皮素-1是否可以促進該細胞合成醛

3、固酮。 二.首先觀察外源性及內源性醛固酮對體外培養(yǎng)的HKC合成致腎間質纖維化致病因子TGF-β1的影響；然后觀察被外源性醛固酮活化的HKC對hRIFs產生COL-Ⅰ的影響。 三.觀察MAPK信號轉導途徑各支通路是否介導醛固酮促進HKC產生TGF-β1的作用。 研究方法一.體外培養(yǎng)的HKC進行試驗，放射免疫方法檢測。(1)刺激試驗：觀察HKC細胞受不同濃度和不同作用時間的ET-1刺激后，ALDO及血管緊張素Ⅱ(An

4、gⅡ)生成量的變化。(2)抑制試驗：固定ALDO刺激條件，觀察不同濃度和不同作用時間的血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)對HKC生成ALDO及AngⅡ的影響。 二.采用體外細胞培養(yǎng)及共培養(yǎng)進行試驗。(1)不同濃度及不同作用時間的外源性ALDO刺激HKC，逆轉錄多聚酶鏈反應(RT-PCR)及酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)方法檢測轉化生長因子-β1(TGF-β1)mRNA及蛋白質表達。(2)不同濃度及不同作用時間的安體舒通與內皮素-1(

5、ET-1)共同刺激HKC，同上檢測TGF-β1mRNA及蛋白質表達。(3)用外源性ALDO活化的HKC與hRIFs共培養(yǎng)(培養(yǎng)液中加或不加抗TGF-β1抗體)，ELISA方法檢測hRIFs的ColⅠ合成量。 三.體外培養(yǎng)的HKC進行試驗，(1)用不同濃度MAPK各支通路的特異性阻滯劑預孵育細胞，再以醛固酮刺激HKC，ELISA方法檢測TGF-β1合成量出現(xiàn)的變化。(2)用不同濃度及不同作用時間的外源性ALDO刺激HKC，ELIS

6、A方法檢測MAPK途徑各支通路磷酸化程度的改變。(3)用10-6mol/L的的安體舒通預孵育細胞2h，再以10-7mol/L醛固酮刺激HKC2h，觀察MAPK各支通路磷酸化程度的改變。研究結果 一.(1)未加任何刺激的HKC細胞能產生基礎量ALDO及AngⅡ。ET-1刺激后ALDO及AngⅡ的生成量均呈劑量依賴及時間依賴性增加，10-9及10-7mol/LET-1刺激48h后ALDO及AngⅡ的生成量顯著高于0mol/LET-1

7、組(P＜0.05或0.01)；10-7mol/L的ET-1刺激12h、24h及48h后ALDO及AngⅡ的生成量也顯著高于Oh組(P＜0.05或0.01)。 (2)用10-7mol/LET-1與不同濃度的ACEI共同孵育HKC細胞48h，結果10-9、10-7及10-5mol/L的ACEI能使AngⅡ及ALDO生成量顯著減少(與0mol/LACEI組比較P＜0.01)，但是，此濃度的ACEI雖能完全阻斷AngⅡ生成，卻未能完全阻

8、斷ALDO生成；用10-7mol/LET-1與10-5mol/LACEI共同孵育HKC細胞，并在不同時間段進行觀察，結果6h及12h時AngⅡ及ALDO的合成均被完全阻斷(與0h比較P＞0.05)，但是24h及48h時ACEI雖能完全阻斷AngⅡ生成，卻不能完全阻斷ALDO生成。 二.(1)外源性ALDO使TGF-β1表達呈劑量依賴及時間依賴性增加。10-9及10-7mol/LALDO刺激組(mRNA水平作用12h、蛋白質水平作

9、用48h)TGF-β1表達量較0mol/LALDO組顯著升高(P＜0.05或0.01)；10-7mol/LALDO刺激不同時間后(mRNA水平為8h、12h及16h，蛋白質水平為12h、24h及48h)，TGF-β1表達量顯著高于0h組(P＜0.05或0.01)。 (2)安體舒通使TGF-β1表達呈劑量及時間依賴性減少。10-9、10-7mol/L安體舒通組(mRNA水平作用12h、蛋白質水平作用作用48h)TGF-β1表達量較

10、0mol/L安體舒通組顯著減少(P＜0.05或P＜0.01)。10-9mol/LET-1加10-7mol/L安體舒通與單用10-9mol/LET-1刺激不同時間后(mRNA水平在12、16h，蛋白質水平在24、48h)，兩組間TGF-β1表達出現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05或0.01)。(3)10-7mol/LALDO刺激HKC12h活化細胞后，再與hRIFs共培養(yǎng)48h，hRIFs對ColⅠ的合成量顯著增多(P＜0.01)；1.0、2.0

11、μg/ml抗TGF-β1抗體能部分抑制此反應(P＜0.05)。 三.(1)15μmol/L及25μmol/L的ERK通路抑制劑(U0126)可以使TGF-β1合成量顯著性減低(P＜0.05)，其余兩條途徑的抑制劑(SP600125、SB203580)未使TGF-β1合成量顯著性減低(P＞0.05)。 (2)10-7mol/LALDO刺激30min后，HKC細胞中磷酸化ERK開始顯著性增加(P＜0.05)，時間延長至2h后

12、ERK磷酸化達到高峰，此后逐漸減低，至6h時磷酸化程度與0h無顯著性差異(P＞0.05)，而JNK和p38兩條途徑的磷酸化均未隨著醛固酮刺激時間延長而出現(xiàn)顯著性增加(P＞0.05)；不同濃度醛固酮對HKC刺激2h后，10-9、10-7mol/L組磷酸化ERK較0mol/L組出現(xiàn)顯著性增加(P＜0.01)，10-11mol/L組磷酸化ERK較0mol/L組未出現(xiàn)顯著性增加(P＜0.05)；不同濃度的醛固酮均未使JNK和p38兩條途徑磷酸化

13、程度出現(xiàn)顯著性增加(P＞0.05)。對相應濃度醛固酮刺激下ERK的磷酸化水平與TGF-β1合成量之間具有顯著相關性(R=0.793，P＜0.01)。 (3)10-7mol/L醛固酮加10-6mol/L安體舒通刺激組磷酸化較僅使用醛固酮刺激組出現(xiàn)顯著性減低(P＜0.05)，與對照組比較無顯著性差異(P＞0.05)。JNK及p38磷酸化程度均無顯著性差異(P＞0.05)。 結論一.人近端腎小管上皮細胞具有合成組織ALDO的能