右美托咪定對(duì)未成熟大鼠異氟醚暴露致大腦神經(jīng)損傷的保護(hù)作用.pdf

1、本課題通過不同濃度異氟醚作用于母體，確定可引發(fā)胎鼠神經(jīng)損傷的濃度;通過不同劑量復(fù)合應(yīng)用右美托咪定，探討右美托咪定有效作用的劑量和方法;采取行為學(xué)方法評(píng)價(jià)異氟醚對(duì)胎鼠的神經(jīng)損傷和右美托咪定的保護(hù)作用;通過透射電鏡(Tansmission electron microscopy，TEM)觀察大腦超微結(jié)構(gòu)，及采用免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BDNF及突觸素（Synaptophysin，Syn），探討其可能的作用機(jī)制。旨在探索右美托咪定有效減輕胎兒期全麻藥

2、神經(jīng)損傷的方法和劑量，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　第一部分不同濃度異氟醚長(zhǎng)時(shí)間吸入致妊娠中期胎鼠大腦異常凋亡
　　目的:
　　模擬妊娠中期婦女非產(chǎn)科手術(shù)的臨床麻醉，對(duì)妊娠第14天母鼠進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間吸入異氟醚麻醉，觀察不同濃度的異氟醚對(duì)胎兒神經(jīng)系統(tǒng)的影響。
　　方法:
　　實(shí)驗(yàn)對(duì)象為50只定時(shí)受孕的SD雌性大鼠，以及其各自的胎鼠。每只母鼠隨機(jī)選擇2個(gè)孕囊，分離出胎鼠，4％多聚甲醛固定后于距額部2mm處取大腦組織

3、切片。TUNEL法檢測(cè)胎鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡量，計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比率。
　　結(jié)果:
　　與Control組比較，吸入異氟醚的各組，凋亡細(xì)胞比率均呈升高，具有顯著性，與Iso2.0組比較，Iso1.5組與其相似(P＞0.05);Control組、Oxy組呈顯著降低。
　　結(jié)論:
　　1.妊娠第14天，母鼠持續(xù)吸入1％、1.5％、2％三種濃度異氟醚4h，胎鼠大腦神經(jīng)元均可于4h后凋亡顯著增加。
　　2.母鼠

4、吸入異氟醚致胎鼠大腦神經(jīng)元凋亡增加作用可能存在劑量依賴性。
　　3.母鼠吸入純氧4h并不增加4h后胎鼠大腦神經(jīng)元凋亡。
　　第二部分不同劑量右美托咪定對(duì)異氟醚致妊娠中期胎鼠神經(jīng)元異常凋亡的保護(hù)作用
　　目的:
　　評(píng)價(jià)應(yīng)用右美托咪定對(duì)妊娠第14天胎鼠長(zhǎng)時(shí)間異氟醚暴露所致神經(jīng)損傷是否具有保護(hù)作用，以及探討其可能的機(jī)制。
　　方法:
　　實(shí)驗(yàn)對(duì)象為70只定時(shí)受孕的SD雌性大鼠，以及其各自的胎鼠。
　

5、　吸入氣體結(jié)束4h后，母鼠使用水合氯醛麻醉，行剖宮取胎術(shù)。每只母鼠隨機(jī)選擇2個(gè)孕囊，分離出胎鼠，4％多聚甲醛固定后于距額部2mm處取大腦組織連續(xù)切片。TUNEL法檢測(cè)胎鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡量，計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比率。免疫組化方法檢測(cè)大腦BDNF、Syn表達(dá)水平，計(jì)算單位面積平均光密度(Mean optical density，MOD)值。
　　結(jié)果:
　　與NS+Iso組比較，Dex10+Iso組、 Dex20+Iso組、

6、Dex20+Oxy組及Control組均呈顯著降低，Dex5+Iso組雖低于NS+Iso組，但差異未有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Dex20+Yoh+Iso組與NS+Iso組相似。與Dex20+Yoh+Iso組比較，Dex5+Iso組、Dex10+Iso組及Dex20+Iso組均顯著降低。
　　各組胎鼠大腦的Syn表達(dá)MOD值相接近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.130，P=0.356)。
　　結(jié)論:
　　1.應(yīng)用右美托咪定10μg

7、/kg、20μg/kg兩種劑量進(jìn)行預(yù)處理和吸入中追加給藥，可減少子宮內(nèi)胎鼠1.5％異氟醚暴露4h所致神經(jīng)元異常凋亡作用。
　　2.右美托咪定通過激動(dòng)α2-AR起神經(jīng)保護(hù)作用，此作用可被育亨賓所拮抗。
　　3.右美托咪定的神經(jīng)保護(hù)作用可能存在劑量依賴性。
　　4.右美托咪定可上調(diào)胎鼠大腦BDNF表達(dá)，BDNF上調(diào)產(chǎn)生的級(jí)聯(lián)反應(yīng)可能參與右美托咪定的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　5.子宮內(nèi)胎鼠1.5％異氟醚暴露4h，無論是否復(fù)合

8、使用右美托咪定，均未觀察Syn表達(dá)顯著改變。
　　6.單獨(dú)使用右美托咪定不引起胎鼠大腦凋亡增加，對(duì)BDNF、Syn表達(dá)無影響。
　　第三章 右美托咪定對(duì)子宮內(nèi)胎鼠異氟醚暴露神經(jīng)保護(hù)作用至大鼠成年期的影響
　　目的:
　　通過行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)應(yīng)用右美托咪定對(duì)妊娠第14天胎鼠長(zhǎng)時(shí)間異氟醚暴露所致胎鼠神經(jīng)損傷的保護(hù)作用是否延續(xù)至成年期，并以解剖學(xué)和免疫組化方法探討其可能的機(jī)制。
　　方法:
　　實(shí)驗(yàn)對(duì)象為5

9、0只定時(shí)受孕的SD雌性大鼠，以及其各自的雄性子鼠。
　　行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，擬行電鏡分析子鼠腹腔內(nèi)注射水合氯醛麻醉，于冰面上取其大腦海馬CA1區(qū)組織行透射電鏡分析，于13500倍鏡下，記錄突觸計(jì)數(shù);于46000倍鏡下，觀察突觸形態(tài)，并測(cè)量突觸間隙和突觸后致密物厚度。擬行免疫組化實(shí)驗(yàn)子鼠腹腔內(nèi)注射水合氯醛麻醉，經(jīng)心臟灌注固定液后解剖取大腦組織進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，分別檢測(cè)Syn、BDNF的表達(dá)程度，計(jì)算其MOD值。
　　行為學(xué)數(shù)據(jù)及

10、實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)使用盲法采集，同母2只子鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取其平均值納入統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料以(x)±s表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中第1天至第4天的潛伏時(shí)間使用重復(fù)測(cè)量資料方差分析，使用LSD法進(jìn)一步行組間比較;其余數(shù)據(jù)使用單因素方差分析，組間比較使用LSD法，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，各組子鼠活動(dòng)距離和平均速度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=0.339，P=0.850; F=

11、0.393，P=0.812）。各組子鼠間大便次數(shù)有顯著差異（F=5.203，P=0.002），Dex+Iso組與Dex+Oxy組及Control組相似(P＞0.05)，顯著少于NS+Iso組（P＜0.05）;而Dex+Yoh+Iso組則和NS+Iso組相似（P＞0.05），顯著高于Control組(P＜0.05);Dex+Iso組大便次數(shù)雖低于Dex+Yoh+Iso組，但差異未有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　Morris水

12、迷宮中，大鼠前4天行定向航行實(shí)驗(yàn)，各組大鼠潛伏期時(shí)間于不同天數(shù)間有顯著差異(F=99.348，P＜0.001)，于第1天最高，第4天最低;各組于第1、2天潛伏期時(shí)間相似(F=0.211，P=0.931; F=0.155，P=0.960)，于第3、4天有顯著差異(F=2.957，P=0.030; F=4.173，P=0.006)。進(jìn)一步對(duì)同一天內(nèi)組間數(shù)據(jù)行兩兩比較，可見第3天，Dex+Iso組與其余各組均無顯著性差異(P＞0.05);De

13、x+Yoh+Iso組則與NS+Iso組相似(P＞0.05)，顯著高于Control組(P＜0.05);Dex+Oxy組和Control組相似(P＞0.05)，顯著低于NS+Iso組(P＜0.05)。第4天，Dex+Iso組、Dex+Oxy組與Control組相似(P＞0.05)，顯著低于NS+Iso組;Dex+Yoh+Iso組與NS+Iso組相似(P＞0.05)，顯著高于Control組(P＜0.05);Dex+Iso組顯著低于Dex+

14、Yoh+Iso組(P＜0.05)。第5天行單次隱匿平臺(tái)尋找實(shí)驗(yàn)，可見各組子鼠首次穿越平臺(tái)位置時(shí)間和穿越次數(shù)有顯著差異(F=3.124，P=0.024;F=4.146，P=0.006)，Dex+Iso組、Dex+Oxy組首次穿越平臺(tái)位置時(shí)間和Control組相似(P＞0.05)，顯著低于NS+Iso組(P＜0.05);NS+Iso和Dex+Yoh+Iso組顯著高于Control組(P＜0.05);Dex+Iso組顯著低于Dex+Yoh+I

15、so組(P＜0.05)。Dex+Iso組、Dex+Oxy組穿越次數(shù)和Control組相似(P＞0.05)，顯著多于NS+Iso組(P＜0.05);NS+Iso和Dex+Yoh+Iso組顯著少于Control組(P＜0.05);Dex+Iso組顯著多于Dex+Yoh+Iso組(P＜0.05)。
　　電鏡分析結(jié)果，各組大鼠突觸個(gè)數(shù)有顯著差異(F=15.771，P＜0.001)。Dex+Iso組、Dex+Oxy組與Control組相似(

16、P＞0.05)，均顯著多于NS+Iso組(P＜0.05);而NS+Iso組和Dex+Yoh+Iso組相似(P＞0.05)，均顯著低于Control組(P＜0.05)。Dex+Iso組顯著多于Dex+Yoh+Iso組（P＜0.05）。各組子鼠突觸間隙寬度及突觸后致密物厚度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.119，P=0.975; F=0.638，P=0.638)。
　　免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，各組間Syn表達(dá)MOD值有顯著差異(F=4.590，P=0

17、.003)，Dex+Iso組、Dex+Oxy組和Control組相似(P＞0.05)，顯著高于NS+Iso組(P＜0.05);而NS+Iso和Dex+Yoh+Iso組顯著低于Control組(P＜0.05);Dex+Iso組顯著高于Dex+Yoh+Iso組(P＜0.05)。各組大鼠BDNF表達(dá)MOD值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=0.363，P=0.834）。
　　結(jié)論:
　　1.應(yīng)用右美托咪定20μg/kg進(jìn)行預(yù)處理和吸入中追加給藥，

18、可對(duì)1.5％異氟醚暴露4h的子宮內(nèi)妊娠第14天雄性子鼠產(chǎn)生長(zhǎng)期影響，表現(xiàn)在:
　　①可減少因子宮內(nèi)異氟醚暴露所致成年期焦慮情緒上升、空間學(xué)習(xí)記憶能力下降等行為異常。
　?、诳蓽p輕成年期大腦海馬CA1區(qū)的突觸數(shù)量下降及Syn表達(dá)下降。
　　2.右美托咪定對(duì)空間學(xué)習(xí)記憶能力的保護(hù)作用，及對(duì)突觸數(shù)量、Syn表達(dá)的保護(hù)作用，均可被育亨賓所拮抗。
　　3.單獨(dú)應(yīng)用右美托咪定對(duì)雄性子鼠成年期行為、突觸數(shù)量及Syn表達(dá)水平無顯