AMACR和Galectin-4蛋白聯(lián)合作為肝細(xì)胞癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移標(biāo)志物的研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌（以下簡稱肝癌）是世界上最為常見的惡性腫瘤之一，每年約有667000個(gè)新發(fā)病例，并且在中國是第二大導(dǎo)致死亡的癌癥。肝細(xì)胞癌的高死亡率主要是與其高的術(shù)后復(fù)發(fā)率有關(guān)，約有75％的患者術(shù)后會出現(xiàn)肝內(nèi)或肝外的轉(zhuǎn)移。近年來，隨著影像學(xué)的發(fā)展，肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的早期診斷率有所提高，但其昂貴的檢查費(fèi)用，仍不適合作為常規(guī)的頻繁檢測項(xiàng)目。因此尋找能判斷肝癌早期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的生物學(xué)標(biāo)志物，預(yù)測肝癌復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)變得迫在眉睫。AMACR和galectin-4這兩

2、種蛋白已經(jīng)被證實(shí)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相聯(lián)系，我們前期的蛋白質(zhì)組學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白與肝癌早期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)，但是查閱相關(guān)文獻(xiàn)并沒有發(fā)現(xiàn)其有關(guān)的臨床報(bào)道，并且它們對肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制也不得而知。
　　目的：⑴檢測AMACR和galectin-4蛋白在肝癌組織中的表達(dá)，結(jié)合臨床病理等資料，評價(jià)其作為預(yù)測肝細(xì)胞癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的分子標(biāo)志物的能力；⑵評價(jià)AMACR和galectin-4兩種蛋白聯(lián)合作為肝細(xì)胞癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移標(biāo)志物的

3、臨床診斷能力；⑶通過在體和體外實(shí)驗(yàn)闡明AMACR和galectin-4蛋白影響肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。
　　方法：①分別選取術(shù)后早期復(fù)發(fā)，晚期復(fù)發(fā)及未復(fù)發(fā)病例行Q-PCR檢測各組肝癌組織中 AMACR mRNA水平。取158例肝癌組織構(gòu)建組織芯片，免疫組化檢測AMACR蛋白表達(dá)水平，分析各臨床病理參數(shù)與 AMACR蛋白表達(dá)量關(guān)系，評價(jià)AMACR蛋白作為判斷肝細(xì)胞癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移標(biāo)志物的潛能。②分別選取術(shù)后早期復(fù)發(fā)，晚期復(fù)發(fā)及

4、未復(fù)發(fā)病例行 Q-PCR、WB檢測各組galectin-4的mRNA和蛋白水平。取201例肝癌患組織構(gòu)建組織芯片，免疫組化檢測galectin-4蛋白表達(dá)水平，分析比較臨床病理參數(shù)與galectin-4的表達(dá)量的關(guān)系。③ELESA實(shí)驗(yàn)檢測肝癌患者血清中AMACR和galectin-4的含量，利用Logistic回歸分析繪制受試者工作特征曲線，并計(jì)算最佳診斷臨界值及其相對應(yīng)的敏感度和特異度，評價(jià)該聯(lián)合標(biāo)志物的診斷價(jià)值。④利用pcDNA3.

5、1質(zhì)粒載體分別構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)AMACR、galectin-4肝癌細(xì)胞株以及沉默表達(dá)AMACR、galectin-4的肝癌細(xì)胞株，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測各細(xì)胞株轉(zhuǎn)移和侵襲能力；裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)評價(jià)AMACR和galectin-4蛋白在體內(nèi)對腫瘤的影響；定量蛋白質(zhì)組實(shí)驗(yàn)對高表達(dá)和敲除galectin-4的穩(wěn)定細(xì)胞株進(jìn)行比較定量分析，展現(xiàn)由 galectin-4引起的肝癌細(xì)胞的蛋白質(zhì)組表達(dá)差異譜，進(jìn)一步探討galectin-4對肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)

6、移和侵襲作用機(jī)制的影響。
　　結(jié)果：⑴Q-PCR結(jié)果顯示AMACR在早期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的肝細(xì)胞癌中在mRNA水平上表達(dá)明顯下降（P=0.004）；組織芯片檢測發(fā)現(xiàn)AMACR蛋白低表達(dá)與AFP血清水平（P=0.012），腫瘤數(shù)目（P=0.005），區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.042），腫瘤包膜（P=0.026）以及門靜脈癌栓（P=0.049）相關(guān)。158例肝癌術(shù)后生存率單因素分析發(fā)現(xiàn)：術(shù)中腹水、腫瘤大小、腫瘤包膜完整度、腫瘤分化程度、門靜脈癌

7、栓以及 AMACR蛋白表達(dá)量與術(shù)后生存時(shí)間相關(guān)；多因素分析顯示，AMACR蛋白可以作為預(yù)后的獨(dú)立判斷因素（P=0.031）。Kaplan-Meier分析結(jié)果示：低表達(dá) AMACR蛋白的患者其中位生存期較高表達(dá)組短（log-rank，P<0.001）。⑵Q-PCR和WB結(jié)果顯示galectin-4在早期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組的肝細(xì)胞癌中mRNA水平及蛋白水平表達(dá)都有明顯的下降。組織芯片檢測發(fā)現(xiàn)galectin-4蛋白低表達(dá)與腫瘤大?。≒=0.036）

8、，組織的低分化（P=0.011），微血管侵犯（P=0.004）以及TNM處于更晚期（P=0.015）相關(guān)。201例肝癌術(shù)后生存率單因素分析發(fā)現(xiàn)：腫瘤大小、腫瘤包膜完整度、腫瘤分化程度、門靜脈癌栓，TMN分期以及 galectin-4蛋白表達(dá)量與術(shù)后生存時(shí)間相關(guān)；多因素分析顯示galectin-4是判斷肝細(xì)胞癌術(shù)后總生存期（P=0.002）的獨(dú)立因素。Kaplan-Meier分析結(jié)果表明galectin-4低表達(dá)患者較高表達(dá)患者具有更高的

9、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率（log-rank，P<0.001）及更短的總生存期（log-rank，P<0.001）。⑶在早期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的肝癌患者中，血清AMACR及galectin-4含量要明顯高于晚期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者（P<0.05）。以165.5 pg/ml作為AMACR診斷早期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移肝癌的臨界值其靈敏度和特異度分別為0.407及1。同樣，將3367.5 pg/mL作為galectin-4診斷早期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移肝癌的臨界值其靈敏度和特異度分別為0.852及0.

10、524。兩種蛋白的曲線下面積分別是0.703（P=0.025）和0.712（P=0.019）。將兩者結(jié)合繪制ROC曲線得到其曲線下面積為0.799（P<0.000）,診斷價(jià)值明顯提升。⑷Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，下調(diào)galectin-4蛋白表達(dá)量能顯著增加肝癌細(xì)胞株的轉(zhuǎn)移和侵襲能力；下調(diào) AMACR蛋白的表達(dá)量在體外對肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力沒有明顯影響。裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)示：低表達(dá)galectin-4蛋白的肝細(xì)胞癌其腫瘤生長速度較高表達(dá)

11、galectin-4蛋白的肝細(xì)胞癌明顯增快（P=0.0496）。而AMAR蛋白對皮下腫瘤生長的影響不明顯。蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示：改變肝癌細(xì)胞株中g(shù)alectin-4蛋白表達(dá)量能引起127種蛋白表達(dá)譜產(chǎn)生較大差異，其多數(shù)蛋白參與肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄翻譯以及脂肪酸、氨基酸代謝等生物學(xué)過程。
　　結(jié)論：①AMACR和galectin-4蛋白肝癌組織中的低表達(dá)可能與術(shù)后早期復(fù)發(fā)相關(guān)，可以作為肝細(xì)胞癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)后標(biāo)志物；②聯(lián)合檢測AMAC