化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法測(cè)定磺胺對(duì)甲氧嘧啶.pdf

1、本課題是將化學(xué)發(fā)光技術(shù)與免疫學(xué)技術(shù)相結(jié)合,即化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法來(lái)定量測(cè)定抗生素藥磺胺對(duì)甲氧嘧啶在食品中的殘留。采用競(jìng)爭(zhēng)法,即將待測(cè)樣品中的磺胺對(duì)甲氧嘧啶與一定量的標(biāo)記有辣根過(guò)氧化物酶的磺胺對(duì)甲氧嘧啶(或標(biāo)記有堿性磷酸酶的磺胺對(duì)甲氧嘧啶)競(jìng)爭(zhēng)性地與固相磺胺對(duì)甲氧嘧啶抗體進(jìn)行結(jié)合,通過(guò)分離未結(jié)合的標(biāo)記抗原,測(cè)定標(biāo)記抗原與抗體復(fù)合物化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度,經(jīng)相應(yīng)的數(shù)學(xué)函數(shù)計(jì)算出待測(cè)抗原的含量。根據(jù)這一基本原理,分別利用魯米諾體系和金剛烷類(lèi)體系作為化學(xué)

2、發(fā)光底物,快速地測(cè)定食品中的磺胺對(duì)甲氧嘧啶殘留量。
　　 本課題主要是從以下幾個(gè)方面進(jìn)行研究:
　　 1辣根過(guò)氧化物酶-魯米諾-過(guò)氧化氫發(fā)光體系的研究
　　 1.1首先是選擇一種理想的方法將酶標(biāo)記在藥物小分子上,經(jīng)篩選得出用重氮化偶聯(lián)法能較好地進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶的標(biāo)記,并用以下三種方法來(lái)鑒定標(biāo)記復(fù)合物:首先是偶聯(lián)物的顏色變?yōu)樽霞t色；其次,從紫外圖譜可以看出偶聯(lián)物在233nm處有一特征吸收峰且有位移；最后,從偶聯(lián)物

3、紅外光譜圖中可以看出:在3500～4000cm-1區(qū)域,2250～2500 cm-1區(qū)域及1250～1750 cm-1區(qū)域有辣根過(guò)氧化物酶中氨基酸的特征峰,在900～1160 cm-1區(qū)域又有磺胺對(duì)甲氧嘧啶的特征峰。
　　 1.2其次優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件,最佳條件為:抗體包被濃度為2.5μg/ml,酶標(biāo)記物工作液稀釋度為1:4,每孔加待測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品50μl和酶標(biāo)記物50μl,在37℃下反應(yīng)1h,洗滌后每孔加發(fā)光底物100μl,避光反應(yīng)

4、1.5min后在發(fā)光檢測(cè)儀下檢測(cè)發(fā)光計(jì)數(shù)。
　　 該方法學(xué)檢測(cè)限為3.2pg/ml,批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于13％,批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于18％。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=-0.0063x+6.6846(x是標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度的對(duì)數(shù),y是發(fā)光強(qiáng)度的對(duì)數(shù)),線性范圍為10～2000pg/ml,相關(guān)系數(shù)為0.9952。
　　 2堿性磷酸酶-金剛烷類(lèi)發(fā)光體系的研究
　　 2.1首先同樣是選擇一種理想的方法將酶標(biāo)記在藥物小分子上,經(jīng)篩選

5、得出用重氮化偶聯(lián)法能較好標(biāo)記堿性磷酸酶,并用三種方法來(lái)鑒定標(biāo)記復(fù)合物:首先是偶聯(lián)物的顏色變?yōu)樽霞t色；其次,從紫外圖譜中可知偶聯(lián)物在238nm處有一特征吸收峰且有位移；最后,從偶聯(lián)物紅外光譜圖中可以看出:在3500～4000cm-1區(qū)域,2250～2500 cm-1區(qū)域及1250～1750 cm-1區(qū)域有堿性磷酸酶中氨基酸的特征峰,在800～1200 cm-1區(qū)域又有磺胺對(duì)甲氧嘧啶的特征峰。
　　 2.2其次優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件,最佳條件

6、為:抗體包被濃度為5.0μg/ml,酶標(biāo)記物工作液稀釋度為1:10,每孔加待測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品50μl和酶標(biāo)記物50μl,在37℃下反應(yīng)1h,洗滌后每孔加發(fā)光底物100μl,避光反應(yīng)25min后在發(fā)光檢測(cè)儀下檢測(cè)發(fā)光計(jì)數(shù)。
　　 該方法學(xué)檢測(cè)限為28.0pg/ml,批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15％,批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于18％。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=-0.0215x+5.1726(x是標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度的對(duì)數(shù),y是發(fā)光強(qiáng)度的對(duì)數(shù)),線性范圍為50

7、～10000pg/ml,相關(guān)系數(shù)為0.9961。
　　 3對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)
　　 3.1用建立起來(lái)的辣根過(guò)氧化物酶-魯米諾-過(guò)氧化氫發(fā)光體系對(duì)牛奶、雞蛋、蜂蜜和血漿中磺胺對(duì)甲氧嘧啶的含量進(jìn)行檢測(cè),回收率分別為:91.0‰～104.0％、84.0％～92.0％、90.0％～113.0％、110.0％～119.0％,符合要求。
　　 3.2將化學(xué)發(fā)光酶免疫分析與酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜法進(jìn)行比較,得知前者的檢測(cè)