基于基因表達芯片技術的鎳離子細胞毒性機理研究.pdf

1、金屬生物醫(yī)學材料鎳鈦合金，由于具有良好的力學、物理、化學性能，以及形狀記憶的智能特性，在人體矯形、介入性治療、牙科、面部治療等醫(yī)學領域得到了廣泛的應用。但是，鎳鈦合金中約含有56wt％的鎳元素，其在體內釋出的鎳離子對生物體潛在的危險沒有排除。為了使鎳鈦合金材料在生物體內的使用更加安全可靠，需要對鎳離子的生物相容性進行長期深入的研究。 本論文的研究目的之一是在細胞毒性實驗的基礎上，采用基因表達芯片技術和生物信息學以及RT-PCR驗

2、證的研究方法，從基因組水平上探索Ni<'2+>離子對細胞的分子毒性機理，評價其分子生物相容性。研究目的之二是探索研究生物材料與機體相互作用的機理的新途徑，為建立基于基因表達芯片技術的生物材料相容性評價的新方法打下基礎。 本論文的研究內容如下： 1．采用MTT法評價了100、200、300μM的鎳離子(Ni<'2+>)溶液處理小鼠結締組織成纖維細胞L929細胞12h、24h、36h、48h、60h、72h后的細胞毒性。實驗

3、結果表明，Ni<'2+>離子在100μM的濃度下對L929細胞的毒性較低，僅在處理時間達到72h時毒性級別達到1級；200μM Ni<'2+>離子在處理12h～36h時毒性影響較小，為0級毒性，處理48h～72h時毒性影響增加，為1級毒性；300μMNi<'2+>離子毒性較前兩個濃度有明顯的增強，處理24h時毒性級別即達到1級，處理時間48h以上時毒性均為2級。總體來說，細胞毒性隨著鎳離子處理濃度的增加而增強，隨著鎳離子處理時間的增加而

4、增強，具有濃度．時間的依賴性。 2．采用流式細胞儀檢測了100、200μM Ni<'2+>處理L929細胞24h、48h、72h后對細胞周期的影響。實驗結果表明，Ni<'2+>作用24h時，兩個濃度組G<,0>/G<,1>期細胞所占的比例較陰性對照組有所下降，S期和G<,2>/M期細胞所占的比例有所上升，其中S期細胞比例上升更為明顯，說明此時Ni<'2+>有促進細胞周期由G<,0>/G<,1>期向S期轉移的作用。但是隨著鎳離子作

5、用濃度的增加，這種轉移能力減弱。而當Ni<'2+>作用時間達到48h和72h的時候，兩個濃度組G<,0>/G<,1>期細胞所占的比例增加，S期和G<,2>/M期細胞所占的比例則相應減少，說明在這兩個時間點上Ni<'2+>可能誘導了L-929細胞停留在G<,0>/G<,1>期，減少了S期細胞，從而使細胞增殖減慢。 3．根據MTT實驗結果，選用100μM濃度的Ni<'2+>離子溶液分別處理L929細胞不同的時間(12h、24h、48

6、h和72h)，以及200μM濃度的Ni<'2+>離子溶液處理L929細胞12h后，提取其細胞總RNA，同時提取了正常細胞的總RNA作為對照，并經質檢合格，以用于基因表達芯片實驗。 4．采用BioStarM-140s芯片(含14112個基因)，分別以100μM濃度的Ni<'2+>離子溶液處理L929細胞12h、24h、48h和72h，200μM濃度的Ni<'2+>離子溶液處理L929細胞12h后的細胞總RNA作為實驗組(共5個實驗

7、組)，以正常細胞總RNA為對照組進行了基因表達芯片實驗。每個實驗組采用兩張同型號的芯片在同樣的實驗條件下進行重復。實驗結果表明，在上述5個實驗組中發(fā)生差異表達的基因數分別為：708個、121個、97個、463個和452個，其中有效的差異表達基因數則分別為：635個、106個、85個、415個和403個。 5．在基因表達值Ratio分析以及基因功能分析的基礎上，篩選出了11個基因對其表達水平進行熒光定量RT-PCR的驗證。驗證結果

8、顯示，有8個基因的表達情況與芯片結果完全一致。說明通過熒光定量RT-PCR實驗技術，大部分基因的表達可以獲得驗證。 6．采用Cluster& TreeView對5個實驗組的差異表達基因(共1201個基因)進行層次聚類分析，發(fā)現：100μM Ni<'2+>處理24h實驗組與100μM Ni<'2+>處理48h實驗組的基因表達差異情況最為相似，其余三個實驗組的差異表達情況則各有差異。100μM Ni<'2+>處理12h、24h、48

9、h和72h后的基因表達時間模式分析顯示，上調組中基因表達模式共有14種，下調組中基因表達模式共有11種。兩者在表達模式的分布上存在著一定的差異，并且，在同一表達模式中的基因富集程度也存在不一致性。 7．利用基于GO(Gene Ontology)基因功能分類體系的GoSurfer、FatiGO+軟件，通過差異表達基因的富集程度來尋找實驗條件相關的基因功能類。分析結果顯示，差異表達基因較為富集的幾個功能類有代謝、定位、細胞通訊、生物

10、學過程的調節(jié)、蛋白質結合、離子結合、核酸結合、水解酶活性、核苷酸結合、轉移酶活性等。 8．采用GenMAPP(Gene MicroArray：Pathway Profiler)軟件對5個實驗組中的差異表達基因參與的路徑進行了分析，發(fā)現在Local MAPPs包含的79個路徑中，有差異基因表達的路徑共57個。其中，包含差異表達基因數大于14個的路徑共有6個，分別為：粘著斑、胰島素信號、mRNA處理的結合過程、電子傳遞鏈、核糖體蛋白