西米特酸抑制PI3K-AKT信號通路及誘導(dǎo)腫瘤細胞程序性死亡（PCD）的研究.pdf

1、一、西米特酸誘導(dǎo)人早幼粒細胞白血病HL-60凋亡的研究 1．西米特酸對HL-60細胞的生長抑制作用黃色的MTT可以被活細胞中的琥珀酸脫氫酶代謝為藍紫色的甲瓚產(chǎn)物，并且其生成量與存活的細胞數(shù)成正比，經(jīng)DMSO溶解后呈紫色或淡紫色，根據(jù)顏色的深淺可判斷活細胞的多少。 2．西米特酸誘導(dǎo)HL-60細胞凋亡 2.1形態(tài)學(xué)改變 1μg/ml西米特酸處理HL-60細胞36h后，Hoechst33258染色可見染色質(zhì)濃集，并可見

2、凋亡小體，而對照組無染色質(zhì)的濃集和凋亡小體的產(chǎn)生，這從形態(tài)學(xué)上說明西米特酸誘導(dǎo)HL-60細胞發(fā)生了凋亡。 2.2 DNA非隨機性降解DNA非隨機性降解是細胞凋亡的重要生物化學(xué)標志 2.3流式細胞儀檢測細胞周期是指一個連續(xù)分裂的細胞從一次分裂完成開始，到下一次分裂完成為止所經(jīng)歷的全過程，可分為G<,0>期、G<,1>期、S期、G<,2>期、M期。腫瘤的一個基本特征是細胞周期調(diào)控機制的破壞，導(dǎo)致細胞的失控性生長。 2

3、.4西米特酸處理HL-60細胞后，capase-3被活化并剪切其下游的PARP，進而誘導(dǎo)細胞凋亡。 2.5 Western blot結(jié)果同樣顯示，DEVD-CHO可阻斷了西米特酸誘導(dǎo)HL-60細胞PARP斷裂帶的產(chǎn)生，表明西米特酸誘導(dǎo)的HL-60細胞的凋亡依賴于caspase-3的功能。 3．西米特酸誘導(dǎo)HL-60細胞凋亡的機制 3.1西米特酸對周期調(diào)控蛋白p16、p27的影響 p16和p27基因是參與調(diào)控腫瘤細

4、胞周期重要的抑癌基因，其表達水平低下或缺失，可導(dǎo)致細胞過度生長，引起腫瘤發(fā)生，而在藥物誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡時常有p16和p27的重新激活。 3.2西米特酸對HL-60細胞c-myc的影響 c-myc是一種原癌基因，在調(diào)節(jié)DNA合成、細胞凋亡、分化及細胞周期的進行中起重要作用。在許多腫瘤中，該基因是決定細胞從G<,0>/G<,1>期進入S期的開關(guān)。c-myc蛋白是一種螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸的拉鏈蛋白，在細胞由正常轉(zhuǎn)向腫瘤性生長過程中起到

5、了至關(guān)重要的作用，其過度表達可使細胞無限增殖，獲永生化功能，促進腫瘤發(fā)生發(fā)展。 3.3西米特酸對HL-60細胞PI3K磷酸化水平的影響 PI3K信號途徑的異常激活在腫瘤中起著重要的作用。結(jié)果顯示，PI3K的總量不變化，而其磷酸化水平則逐漸降低。 3.4西米特酸對HL-60細胞AKT磷酸化水平的影響 Akt是PI3K下游最重要的信號分子，磷酸化的Akt可以激活下游靶分子，進而發(fā)揮其細胞生存和抗凋亡作用。結(jié)果顯示，Akt的總

6、量無變化，而Akt的磷酸化水平則隨著時間的延長逐漸降低，這與其上游分子PI3K的磷酸化水平改變趨勢基本相同。 4．西米特酸誘導(dǎo)HL-60細胞凋亡其他可能的機制為進一步闡明西米特酸誘導(dǎo)HL-60細胞凋亡的機制，結(jié)果顯示1μg/ml西米特酸處理HL-60細胞24h和4 8h后p73、JunD、GADD45A、PPP1R15A、TNFAIP3等多種基因表達升高，MAP2K5、IGF2R等多種基因表達降低。為驗證基因芯片的結(jié)果，我們用R

7、T-PCR法檢測了部分基因的mRNA的改變情況。如圖所示，1μg/ml西米特酸處理HL-60細胞24h和48h后p73、JunD、GADD45A、PP1R15A、TNFAIP3的mRNA表達增高，而MAP2K5、IGF2R的mRNA表達水平則降低，這個結(jié)果與基因芯片的結(jié)果相吻合。有研究證明，p73可轉(zhuǎn)錄激活p53應(yīng)答基因，引起細胞周期抑制、分化和誘發(fā)細胞凋亡，Gong等的研究表明，p73可不依賴于p53功能、被非受體酪氨酸激酶通過ATM

8、磷酸化進而發(fā)揮細胞周期抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用，我們進一步檢測西米特酸誘導(dǎo)HL-60細胞凋亡的過程中，p73蛋白水平是否改變。Western blot結(jié)果顯示，1μg/ml西米特酸處理HL-60細胞后，P73蛋白水平均比對照組高，表明p73蛋白可能參與西米特酸誘導(dǎo)HL-60細胞凋亡過程。 二、西米特酸誘導(dǎo)Hep3B細胞發(fā)生自噬性死亡的研究 1、西米特酸對Hep3B細胞的生長抑制作用首先，我們用MTT法檢測了西米特酸對Hep3

9、B細胞增殖的影響。以0.125、0.25、0.5、1和2μg/ml西米特酸處理Hep3B細胞72h，對Hep3B細胞的生長抑制率分別為10.4﹪、12.4﹪、 23.3﹪、89.1﹪和96.6﹪，與對照組相比，該藥能明顯抑制Hep3B細胞的增殖(P<0.05)，并呈濃度依賴性，其IC<,50>為0.57μg/ml。這說明西米特酸在體外能顯著抑制Hep3B細胞的增殖。 2、西米特酸對Hep3B細胞caspase-3和PARP的影響

10、上文已證明西米特酸對Hep3B細胞有較強的抑制作用。但是否可誘導(dǎo)Hep3B細胞凋亡尚不清楚。取對數(shù)生長期的Hep3B細胞，以1μg/ml西米特酸處理Hep3B細胞6h，12h，24h，36h，48h后，caspase-3和PARP蛋白并無明顯改變，也無凋亡時典型的斷裂帶的產(chǎn)生，表明，西米特酸誘導(dǎo)Hep3B死亡不是通過細胞凋亡方式實現(xiàn)，可能是通過其他的細胞死亡方式。 3、西米特酸誘導(dǎo)Hep3B細胞發(fā)生自噬性死亡 3.1 丫

11、啶橙(Acridine orange)染色上文已排除西米特酸誘導(dǎo)Hep3B細胞為非凋亡性死亡。Aridine orange(AO)是可以染色細胞內(nèi)的酸性小體，如溶酶體等。細胞發(fā)生自噬時，因溶酶體參與形成自噬溶酶體，致使pH值升高，胞內(nèi)的酸性小體減少，因此AO染色可作為一種自噬的指示劑。我們以1μg/ml西米特酸處理Hep3B細胞36h后，以AO染色，結(jié)果表明，在西米特酸處理Hep3B細胞36h后，酸性小體(紅色)比對照組明顯減少，細胞呈

12、現(xiàn)圓形、胞漿淡綠色改變，表明溶酶體等酸性小體減少、酸性被中和，提示自噬可能是西米特酸誘導(dǎo)Hep3B細胞死亡的方式。 3.2 Monodansylcadaverine染色 Monodansylcadaverine(MDC)是細胞自噬特異性的染色劑，在紫外激發(fā)下，自噬小體呈現(xiàn)藍色。1μg/ml西米特酸處理Hep3B細胞36h后，以MDC染色10min，激光共聚焦顯微鏡下紫外光激發(fā)，結(jié)果顯示，在西米特酸處理Hep3B細胞36h后，細胞

13、內(nèi)出現(xiàn)明顯的藍色小體，表明西米特酸誘導(dǎo)Hep3B細胞死亡是一種自噬性細胞死亡。 3.3西米特酸對LC3-Ⅱ的影響 LC3是哺乳動物細胞中酵母Atg8基因的同源物，定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，是細胞自噬泡膜的通用標記物。細胞中新合成的LC3經(jīng)過加工，成為胞漿可溶性LC3-Ⅰ，后者經(jīng)泛素樣加工修飾過程，與自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合，形成LC3-Ⅱ，其含量的多少反映了細胞的自噬活性。 4、西米特酸誘導(dǎo)Hep3B自

14、噬的機制 4.1 西米特酸對PI3K磷酸化水平的影響 Hep3B細胞中PI3K/AKT信號途徑被異常激活，有研究表明，細胞自噬過程中常有PI3K/AKT信號通路的參與。為檢測西米特酸誘導(dǎo)Hep3B細胞自噬過程中PI3K途徑是否受影響，我們用1μg/ml的西米特酸處理Hep3B細胞6h、12h、24h、36h、48h等不同時間后，Western blot方法檢測PI3K的磷酸化水平。結(jié)果顯示，PI3K的總量不變化，而其磷酸化水平則

15、逐漸降低。表明西米特酸誘導(dǎo)Hep3B細胞自噬過程中有PI3K的抑制。 4.2 西米特酸對Akt磷酸化水平的影響上文已證實西米特酸誘導(dǎo)Hep3B自噬性死亡時磷酸化PI3K水平逐漸降低，我們進一步檢測PI3K下游分子Akt是否發(fā)生改變。用1μg/ml的西米特酸處理Hep3B細胞6h、12h、24h、36h、48h后，Western blot檢測顯示，隨時間的推移Akt磷酸化水平逐漸降低，而Akt總量無改變，表明Akt可能參與了西米特

16、酸誘導(dǎo)Hep3B發(fā)生自噬性死亡的過程，并且其變化趨勢與磷酸化的PI3K的變化一致。 4.3西米特酸對FKHR和mTOR磷酸化水平的影響 FKHR和mTOR是Akt下游重要的分子，活化的AKT通過磷酸化多個靶蛋白使它們失活傳遞存活信號，失活轉(zhuǎn)錄因子FKHR，磷酸化mTOR使得細胞存活、增殖等。mTOR激酶是氨基酸、ATP和激素的感受器，對細胞生長具有重要調(diào)節(jié)作用，也是自噬的負調(diào)控分子，通過抑制mTOR的活性，可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。在以

17、1 μ g/ml的西米特酸處理Hep3B細胞6h、12h、24h、36h、48h后，Western blot檢測顯示，F(xiàn)KHR和mTOR的磷酸化水平均逐漸減少，表明FKHR和mTOR可能參與了西米特酸誘導(dǎo)Hep3B細胞自噬性死亡的過程。 5、西米特酸誘導(dǎo)Hep3B細胞自噬的其它機制為探討西米特酸誘導(dǎo)Hep3B自噬是否有其它通路參與，我們研究了Hep3B對STAT通路的影響。正常細胞中STAT信號通路被激活是瞬時的過程，而在許多腫