不同給藥方式下三氧化二砷對裸鼠T細胞淋巴瘤模型體內(nèi)及體外作用實驗研究.pdf

1、研究背景： 惡性淋巴瘤(malignantlymphoma)是淋巴結(jié)及其他器官中的淋巴組織惡性腫瘤，是造血系統(tǒng)常見惡性疾病之一，分為霍奇金病(Hodgkin'sdisease，HD)及非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin'slymphoma，NHL)兩大類。在我國常見惡性腫瘤中占第8位，每年發(fā)病2～4/10萬人口。目前，T細胞來源的非霍奇金淋巴瘤(NHL)化療效果較B細胞來源的NHL差，預后不良，特別是復發(fā)難治T細胞NHL預后

2、兇險。挽救方案均有一定的療效，有效率在30﹪～50﹪，緩解時間較短，長期緩解約為10﹪，自體造血干細胞支持下的超大劑量化療，能夠明顯提高遠期療效，但仍有相當部分復發(fā)NHL死于本病。因此，臨床上仍需尋找新的藥物以期能進一步改善NHL患者預后。 三氧化二砷在20世紀中后期治療急性早幼粒細胞白血病取得了滿意的效果，隨著對砷劑了解的逐步加深，國內(nèi)外學者已不僅局限應用As<,2>O<,3>治療急性早幼粒細胞白血病，不少學者正在試用于惡性淋

3、巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤等惡性血液病及肝癌等實體腫瘤，基礎研究及臨床研究均顯示出誘人的應用前景。國內(nèi)外基礎研究顯示As<,2>O<,3>體外單藥、聯(lián)合其他藥物及方法如放療等均可以抑制多種惡性淋巴瘤細胞株的增殖。臨床方面，單藥As<,2>O<,3>治療復發(fā)難治性惡性淋巴瘤有效率約在21.4﹪～75﹪之間，大多數(shù)報道臨床不良反應輕。所以，不少報道認為As<,2>O<,3>是值得在復發(fā)耐藥NHL深入研究的藥物之一。國內(nèi)外多篇As<,2>O<,3>有

4、關(guān)人體內(nèi)藥代動力學研究顯示目前常規(guī)劑量給藥后3-4h達藥物峰濃度，在人體內(nèi)代謝呈二房室模型特征，其代謝產(chǎn)物清除主要通過尿液，并且清除迅速，僅在部分組織內(nèi)蓄積，無明顯血液蓄積作用，可應用于嚴重腎功能不良的患者。當前臨床常規(guī)用藥多采用單次多天方式，即0.1～0.2mg/kg，連續(xù)治療14天左右。根據(jù)國內(nèi)外臨床使用本藥物經(jīng)驗，嚴重副反應報道少見，多表現(xiàn)為肝功能輕度異常，Q-T間期延長及輕度消化道反應等，安全性較佳。因此，按照藥代動力學特點及目

5、前臨床不良反應情況，結(jié)合當前每天較低劑量較長時間的給予As<,2>O<,3>的問題，故考慮是否可以改變目前給藥方式，探討加大每天劑量，縮短整體治療時間的可行性。 目的： 本文基于國內(nèi)外眾多學者在As<,2>O<,3>在治療惡性淋巴瘤的臨床及基礎學研究結(jié)論，試圖通過動物體內(nèi)外實驗，改變常規(guī)As<,2>O<,3>給藥方式探討相同總治療劑量下．As<,2>O<,3>不同給藥方式治療淋巴瘤的可行性及相關(guān)不良反應研究。本文主要目的

6、通過Annexin V/PI雙染色法、流式細胞儀及MTT法檢測三氧化二砷對鼠源性T細胞淋巴瘤EL4細胞株的體外抑制作用，驗證體內(nèi)實驗可行性。進一步建立裸鼠T細胞淋巴瘤動物模型，采用不同給藥方式研究三氧化二砷對動物體內(nèi)T細胞淋巴瘤抗瘤作用，著重觀察As<,2>O<,3>對腫瘤抑瘤率和了耐受性等。初步了解As<,2>O<,3>新的給藥方法對T細胞淋巴瘤療效及不良反應的變化情況。為臨床更合理應用As<,2>O<,3>提供新的科學依據(jù)。

7、 1．As<,2>O<,3>對T細胞淋巴瘤株EL4的體外實驗研究 通過MTT法檢測8種濃度的三氧化二砷對鼠源性T細胞淋巴瘤EL4細胞株的作用，在Spectra Max M2酶標儀上以試驗波長570nm，參比波長450nm測定光密度值(OD值)，按照公式：抑制率(﹪)=[(OD陰性孔．OD給藥孔)/OD陰性孔]×100﹪測定三氧化二砷對EL4細胞株抑率。流式細胞儀分析、Annexin-V-FITC/PI雙標記及電鏡檢測細胞凋亡比例

8、及凋亡形態(tài)變化。結(jié)果顯示：各濃度組的As<,2>O<,3>對T細胞淋巴瘤EL4細胞均存在直接抑制作用，并呈時間及劑量依賴性。流式細胞分析各濃度均對EL4細胞有一定抑制作用，隨著濃度的增大，凋亡細胞數(shù)量逐漸增多。熒光顯微鏡觀察到腫瘤細胞凋亡形態(tài)。電鏡下出現(xiàn)典型細胞凋亡小體。 2．As<,2>O<,3>對T細胞淋巴瘤荷瘤裸鼠移植瘤生長作用的實驗研究 建立T細胞淋巴瘤EL4細胞荷瘤裸鼠移植瘤模型，隨機分組為實驗組和對照組，具體

9、分組如下：A14組：As<,2>O<,3> 4mg/kg，dl-7，停藥觀察至d14；A7組：As<,2>O<,3> 4mg/kg，dl-7；B14組：As<,2>O<,3> 2mg/kg，dl-14；對照組：生理鹽水，dl-14，腹腔注射。檢測腫瘤體積變化和瘤重，計算抑瘤率，光鏡下觀察腫瘤組織病理學改變，并行組織學觀察肝臟病理變化。實驗結(jié)果為，實驗組較對照組腫瘤生長速度減慢，各實驗組抑瘤率分別為：A7組77.9﹪，A14組58.8﹪，

10、B14組55.6﹪。A14組較B14組療效稍好，但差異無統(tǒng)計學意義，故認為4mg/kg×7天組與2mg/kg×14天組療效相當。藥物不良反應方面：實驗組A7 2只裸鼠及A14組1只裸鼠出現(xiàn)體重下降現(xiàn)象，其中A7組1只裸鼠24小時體重下降超過1g，并于實驗第6日死亡，另外A14組1只裸鼠于實驗第10日死亡，另外1只裸鼠在停藥后體重逐漸增長。各實驗組分別在給藥結(jié)束后1天檢測血常規(guī)，A7組全部裸鼠白細胞較A14、B14組明顯下降，A7組1只裸

11、鼠血小板下降明顯。根據(jù)臨床前動物實驗劑量，推測人體臨床試驗單次使用參考劑量應小于30mg/d。 結(jié)論： 1．As<,2>O<,3>體外實驗表明可抑制T細胞淋巴瘤EL4細胞株生長。 2．流式細胞儀分析及Annexin-v-FITC和PI雙標記檢測表明As<,2>O<,3>主要作用機制為誘導腫瘤細胞凋亡。 3．動物實驗體內(nèi)實驗表明As<,2>O<,3>相同總劑量下，4mg/kg×7天與2mg/kg×14天的給