溶血磷脂酸信號在出生后心臟發(fā)育中的變化及其生物學功能的探討.pdf

1、近年來先天性心臟?。ㄏ刃牟。┌l(fā)病率呈顯著上升趨勢，已成為我國出生缺陷的首位病種，外科矯治是根治先心病最主要的手段，但由于我國特殊的實際情況使得先心病的外科治療面臨許多亟待解決的問題。先心病外科治療的主要時間窗是出生后，雖然心臟在出生時已經(jīng)完成大體結(jié)構(gòu)的發(fā)育，但在功能上尚需經(jīng)歷出生后一定時間的生長方可達到成熟，對出生后心臟的發(fā)育特點和調(diào)節(jié)機制的研究無疑是先天性心臟病外科干預研究的首要任務。雖然心臟在胚胎期的發(fā)育過程已經(jīng)得到廣泛的研究，但是

2、對于出生后未成熟心肌經(jīng)歷怎樣的過程轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒煨募∫约罢{(diào)控這種轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵機制卻知之甚少。
　　 溶血磷脂酸(lysophosphatidica cid，LPA)是一類內(nèi)源性生物活性脂類信號分子，屬于溶血磷脂(lysophospholipids)分子的重要成員，通過其特異性G蛋白耦聯(lián)受體發(fā)揮廣泛的生物學效應。雖然LPA受體在哺乳動物胚胎心臟中的表達早有報道，但LPA及其介導的信號通路在心臟發(fā)育過程中究竟發(fā)揮什么功能卻至今不明。本研究

3、在課題組以往研究的基礎上，為進一步探索LPA信號在心血管系統(tǒng)中的作用，尤其是出生后心臟發(fā)育成熟中的角色，首先對目前已經(jīng)確認的所有溶血磷脂受體（包括LPA的5種受體以及另一種溶血磷脂分子1磷酸鞘胺醇(S1P)的5種受體）從胚胎末期到成年期在大鼠心臟的表達變化進行了分析，然后依據(jù)發(fā)育表達譜所提供的線索，對LPA在出生后心臟成熟過程中可能參與調(diào)控的生物學過程進行了功能學探索。
　　 研究內(nèi)容主要包括三部分：
　　 第一部分溶血

4、磷脂受體在大鼠心臟發(fā)育中變化——從胚胎末期到成年期
　　 這部分研究主要通過實時熒光定量PCR、Western Blot和組織免疫化學的方法對10種溶血磷脂受體（Lpar1-5和Slpr1-5）在大鼠心臟中從胚胎末期到成年期的表達變化進行了分析，主要研究發(fā)現(xiàn)包括：
　　 (1)Lpar1、Lpar3、Lpar4、S1pr1、Slpr2、Slpr3為大鼠心臟主要的溶血磷脂受體亞型；
　　 (2)Lpar1、Lpar

5、3和Lpar4的表達在出生后心臟發(fā)育過程呈現(xiàn)明顯的發(fā)育變化，在出生后2-3周內(nèi)的表達顯著高于之后的表達，提示可能與出生后心臟功能的成熟相關(guān)；
　　 (3)Lpar1和Lpar4在出生后1周表達明顯增加，之后迅速下降，提示可能與出生后早期由于心肌細胞增殖而表現(xiàn)的心臟快速生長有關(guān)；
　　 (4)Lpar3在出生后1天的主動脈壁和冠狀血管壁呈現(xiàn)高表達，提示LPA-Lpar3可能參與心臟血管的發(fā)育；
　　 (5)S1pr

6、1、S1pr2、S1pr3雖然在心臟高表達，但在出生后心臟發(fā)育過程中其表達并沒有發(fā)生明顯變化，提示S1P信號對心臟功能具有重要調(diào)節(jié)作用但在發(fā)育過程中并不發(fā)生角色轉(zhuǎn)換。
　　 第二部分溶血磷脂酸對未成熟心肌細胞的促增殖作用及其信號機制初探
　　 這部分研究在第一部分研究基礎上探討LPA及其受體是否調(diào)節(jié)了出生后早期未成熟心肌細胞的增殖過程。利用免疫熒光標記心肌細胞直接計數(shù)和細胞增殖標志物Ki67，我們首次發(fā)現(xiàn)LPA不僅對出生

7、后早期仍有增殖能力的P1d心肌細胞具有促增殖作用，并且對已經(jīng)失去增殖能力的P4d心肌細胞同樣具有明顯的促增殖作用，并且均呈現(xiàn)劑量依賴和時間依賴關(guān)系。Lpar3受體特異性激動劑OMPT對未成熟心肌細胞具有顯著的促增殖作用，而Lpar1/Lpar3的拮抗劑Ki16425則可以完全阻斷LPA的促增殖作用，同時，Lpar1、Lpar3和Lpar4在心臟不同細胞的表達分布顯示Lpar3在心肌細胞的表達遠遠高于心臟成纖維細胞，而Lpar1和Lpar

8、4則恰好相反，提示Lpar3可能主要參與了心肌細胞的功能調(diào)節(jié)，而Lpar1和Lpar4則主要介導心臟成纖維細胞的生物學效應，由此，我們認為LPA可能是通過Lpar3介導了其對未成熟心肌細胞的促增殖作用。另外，LPA及其受體信號的激活可使進入S期的心肌細胞明顯增加，提示LPA信號可能通過影響心肌細胞周期的進程發(fā)揮促增殖作用。
　　 第三部分溶血磷脂酸對出生后心肌細胞收縮及興奮-收縮耦聯(lián)的影響
　　 這部分研究仍然是以第一部

9、分的研究結(jié)果為線索，力圖證明在心肌收縮功能尚未成熟時，LPA可以通過促進肌細胞內(nèi)鈣離子濃度的增加參與心肌收縮興奮-收縮耦聯(lián)過程進而促進心肌細胞的收縮。但是，通過本部分研究我們沒能證實最初的研究假設，但仍然有以下重要的研究發(fā)現(xiàn)：
　　 (1)不同于研究假設的是，LPA對出生后14天大鼠心肌細胞的收縮和鈣瞬變均沒有顯著影響，但符合研究假設的是，LPA不影響出生后21天大鼠心肌細胞的收縮和鈣瞬變，表明LPA信號并不參與出生后14-21

10、天大鼠心肌細胞的興奮-收縮耦聯(lián)過程和心肌細胞收縮；
　　 (2)在大鼠出生后發(fā)育過程中，Lpar1、Lpar3和Lpar4在整體心臟表達下調(diào)的時間點與在心肌細胞的下調(diào)時間點并不一致，由整體心臟的出生后21天提前到心肌細胞的出生后14天，提示在出生后14天LPA受體對心肌細胞的發(fā)育調(diào)節(jié)功能可能即己減弱或消失；
　　 (3)大鼠心臟的左室射血分數(shù)在出生后14天即保持穩(wěn)定，與成年心臟呈現(xiàn)相同的水平，表明大鼠心肌收縮功能可能在出

11、生后14天已達到成熟。
　　 綜合此3點研究發(fā)現(xiàn)，我們認為本研究的部分假設——當心肌功能成熟時，LPA所介導的鈣信號減弱甚至消失，不再參與成熟心肌細胞的興奮-收縮耦聯(lián)和收縮過程——可能仍然是成立的。
　　 總之，本研究探索了一種內(nèi)源性生物活性分子——LPA在出生后心臟發(fā)育成熟中變化及其對未成熟心肌細胞增殖和收縮的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)了LPA信號對心血管系統(tǒng)的新的生物學調(diào)節(jié)功能，加深了對未成熟心肌生長調(diào)節(jié)的認識，為先心病的外科治