豬呼腸孤病毒SC-A株的分離鑒定及全基因組cDNA文庫的構(gòu)建和分子遺傳特征分析.pdf

1、哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒，通常又直接稱作呼腸孤病毒(Reovirus)，隸屬于正呼腸孤病毒屬(Orthoreovirus)成員，主要感染人和哺乳動(dòng)物，如豬、牛、犬、馬、貓、鼠等動(dòng)物的呼吸道或消化道，具有廣泛的致病性。雖然目前對(duì)呼腸孤病毒與人類疾病的確切關(guān)系尚無定論，但早在1967年Tillotson等就曾報(bào)道呼腸孤病毒可導(dǎo)致人類致死性間質(zhì)性肺炎的發(fā)生，且在對(duì)SARS病原的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)SARS的發(fā)生可能與呼腸孤病毒的同時(shí)感染有關(guān)。目前已報(bào)道的

2、豬呼腸孤病毒共3種血清型，在豬群中廣泛存在，對(duì)豬具有一定的致病性。研究表明用人呼腸孤1型病毒感染仔豬后能從仔豬糞樣中再次檢測(cè)到病毒，同時(shí)還可引起仔豬體溫的瞬間升高且具傳染性，提示應(yīng)該謹(jǐn)慎對(duì)待呼腸孤病毒，特別是應(yīng)對(duì)呼腸孤病毒與動(dòng)物和人類疾病的關(guān)系作進(jìn)一步研究。 本文在國內(nèi)首次成功地從仔豬腹瀉糞樣中，分離并鑒定了一株豬呼腸孤病毒，并命名為豬呼腸孤病毒SC.A株(PReoV SC-A)。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)后，最終確定的胰酶在病毒培養(yǎng)液中的最佳

3、工作濃度為.51μg/mL。PReoV SC-A在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代，增殖穩(wěn)定，并表現(xiàn)出以細(xì)胞內(nèi)顆粒增多、細(xì)胞腫脹及漂落為特征的CPE。病毒粒子在感染細(xì)胞胞漿內(nèi)呈典型的晶格狀排列，并在細(xì)胞核周圍形成大小不等、無定形的病毒包涵體；包涵體中含有致密核心的成熟病毒粒子(實(shí)心)和有透明核心的不完全裝配的病毒粒子(空心)，以及少量平行排列的特征性的微管樣結(jié)構(gòu)。負(fù)染可見病毒粒子為無囊膜的球形顆粒，表面分布有大量似放射狀排列的殼粒。 與其

4、它哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒一樣，PReoV SC-A也能在如Vero、ST、MDBK、BHK21等多種傳代細(xì)胞上增殖，其中Vero傳代細(xì)胞為分離或增殖呼腸孤病毒最常選用的細(xì)胞；除Vero細(xì)胞外，與MDBK及BHK21相比，ST細(xì)胞則更適合用于PReoVSC.A的增殖傳代。形態(tài)發(fā)生學(xué)觀察結(jié)果表明，PReoV SC-A最早的轉(zhuǎn)錄翻譯與組裝發(fā)生在接毒后的4h內(nèi)，而病毒包涵體的最早形成時(shí)間為接毒后的4～6h；在接毒8～10h后，即可在細(xì)胞外見到可能通

5、過細(xì)胞裂解方式而被釋放的病毒粒子。同時(shí)，在感染細(xì)胞中，還可見有細(xì)胞核固縮、呈不規(guī)則分葉狀，染色質(zhì)濃縮、邊集，但細(xì)胞輪廓尚保存完好的細(xì)胞凋亡的早期或中期特征。對(duì)于在接毒后2～8h內(nèi)，糖原顆粒在胞漿中的大量聚集現(xiàn)象，推測(cè)其可能是為病毒的轉(zhuǎn)錄復(fù)制提供必要的能量。 目前，關(guān)于豬呼腸孤病毒的研究報(bào)道極少，更無關(guān)于病毒基因組信息的報(bào)道。為揭示豬呼腸孤病毒基因組的分子生物學(xué)特征，有必要進(jìn)行該病毒基因組cDNA文庫的構(gòu)建a本文根據(jù)呼腸孤病毒基因

6、組特有的末端保守序列特征和瓊脂糖凝膠電泳特性，探索出了一條以經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收的dsRNA或混合總RNA為模板，以特異性引物或與隨機(jī)引物相結(jié)合，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，快速擴(kuò)增出全長(zhǎng)cDNA的呼腸孤病毒全基因組cDNA文庫構(gòu)建策略。應(yīng)用該策略，本文成功擴(kuò)增并克隆了PReoVSC-A各基因組節(jié)段的全長(zhǎng)cDNA，并由此構(gòu)建了含10個(gè)重組質(zhì)粒的PReoV SC-A全基因組cDNA文庫。病毒全基因組的測(cè)序結(jié)果表明，PReoV SC-A基因組全長(zhǎng)

7、23.539Kb，其中L1基因組大小為3854bp、L2大小為3915bp、L3為3901bp：M1為2304bp、M2為2203bp、M3為2241bp、S1為1416 bp、S2為1311 bp、S3為1198 bp、S4為1196 bp。在GenBank中的登錄號(hào)分別為L(zhǎng)1 DQ997719，L2 DQ885990，L3DQ403254，M1 DQ396804，M2 DQ482462，M3 DQ403254，S1 DQ396805

8、，S2DQ411553，S3 DQ396806，S4 DQ911244。 PReoV SC-A的基因組序列分析表明，PReoV SC-A各基組因節(jié)段在分子進(jìn)化上是彼此獨(dú)立的，除決定病毒血清型的S1基因組節(jié)段外，其余節(jié)段都相對(duì)保守。PReoVSC-A與各標(biāo)準(zhǔn)株(T1L、T2J、T3D)在s1基因組節(jié)段上的差異極大，其氨基酸序列相似性分別為21.1％、22.4％和91.2％?；赟1基因組節(jié)段的推導(dǎo)氨基酸序列繪制的分子進(jìn)化樹，支持相

9、同血清型的病毒株位于同一進(jìn)化分支中。據(jù)此，本文將PReoVSC-A的血清型鑒定為血清3型。PReoV SC-A各基因組節(jié)段除具有相同的末端保守序列5'-GCTA……TCATC-3’外，在5’和3’末端保守序列附近還存在一對(duì)倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列。PReoV SC-A僅在Leu、Arg、Ser以及終止密碼子(從不用TAG)上表現(xiàn)出明顯密碼子偏愛性，真核表達(dá)系統(tǒng)尤其酵母系統(tǒng)更適合PReoV SC-A基因的體外表達(dá)。 推導(dǎo)蛋白的預(yù)測(cè)結(jié)果表明：P