牛肌肉與脂肪發(fā)育相關(guān)lncRNA lncFAM200B的鑒定、啟動(dòng)子活性及遺傳變異研究.pdf

1、肌肉和脂肪組織是牛肉的主要組成部分，為此，發(fā)掘調(diào)控牛肌肉與脂肪生成的關(guān)鍵基因，對(duì)提高牛肉品質(zhì)和肉牛生長(zhǎng)發(fā)育性狀具有重要意義。目前已知大量編碼蛋白的基因?qū)∪馀c脂肪的發(fā)育具有重要調(diào)控作用，例如:調(diào)控肌肉發(fā)育關(guān)鍵基因MyoD和MyHC，調(diào)控脂肪生成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα和PPARγ，以及同時(shí)對(duì)肌肉和脂肪的發(fā)育具有調(diào)控作用的Sirt1和Klf5等。近年來(lái)，越來(lái)越多的具有調(diào)控功能的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)被揭示，但大多數(shù)與肌肉、脂肪

2、發(fā)育相關(guān)的研究只是利用測(cè)序的方法揭示一些候選lncRNAs，對(duì)候選lncRNAs功能的研究相對(duì)較少。因此，本研究以牛為研究對(duì)象，從實(shí)驗(yàn)室前期測(cè)序結(jié)果中篩選出候選lncRNA，并利用RACE、生物信息學(xué)分析、原核表達(dá)、雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)和qRT-PCR等現(xiàn)代生物技術(shù)，對(duì)肌肉與脂肪發(fā)育相關(guān)lncRNAlncFAM200B進(jìn)行鑒定、啟動(dòng)子活性及遺傳變異研究，以期為深入探討lncRNA的功能與作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為提高牛肉品質(zhì)與生長(zhǎng)發(fā)育性狀等提供

3、科學(xué)資料。
　　1.牛長(zhǎng)鏈非編碼RNA lncFAM200B的全長(zhǎng)克隆、鑒定與表達(dá)規(guī)律研究
　　本實(shí)驗(yàn)室前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，新lncRNA lncFAM200B在秦川牛胎牛、犢牛、成年牛肌肉組織中差異表達(dá)。本試驗(yàn)利用RACE對(duì)lncFAM200B的序列特征進(jìn)行研究，獲得了lncFAM200B共472bp的全長(zhǎng)序列;原核表達(dá)分析顯示lncFAM200B不具備蛋白編碼的能力;生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示:lncFAM200B啟動(dòng)子

4、區(qū)3000bp序列中包含30個(gè)C/EBPα和7個(gè)CEBPβ等與脂肪細(xì)胞生成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，43個(gè)SP1轉(zhuǎn)錄因子潛在的結(jié)合位點(diǎn)，其中，SP1富集區(qū)域易與肌肉發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子MyoD結(jié)合。lncFAM200B在肌肉和脂肪中的表達(dá)分析顯示lncFAM200B在秦川牛犢牛肌肉中的表達(dá)水平顯著低于在胎牛、成年牛肌肉中的表達(dá)水平。與此同時(shí)，在犢牛、成年牛脂肪中的表達(dá)水平均高于在同一時(shí)期肌肉中的表達(dá)水平。這些研究結(jié)果表明lncFAM200B可

5、能影響牛肌肉與脂肪發(fā)育。
　　2.牛長(zhǎng)鏈非編碼RNA lncFAM200B基因啟動(dòng)子活性研究
　　生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)牛lncFAM200B基因可能與脂肪與肌肉發(fā)育相關(guān)，因此，本研究利用人胚腎293T、小鼠成肌細(xì)胞C2C12和前脂肪細(xì)胞3T3-L1細(xì)胞系，通過(guò)構(gòu)建并轉(zhuǎn)染包含lncFAM200B啟動(dòng)子不同截短體的pGL3-Basic重組質(zhì)粒并檢測(cè)雙熒光素酶活性，進(jìn)一步分析lncFAM200B基因啟動(dòng)子區(qū)的活性區(qū)域。結(jié)果顯示，在2

6、93T、C2C12、3T3-L1三種細(xì)胞系中，不同截短體對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度的變化趨勢(shì)是一致的，從pGL3-pro4（-403）縮短到pGL3-pro5（-139）的過(guò)程中，熒光活性出現(xiàn)了極顯著的降低(P＜0.01)，提示轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之前-403至-139bp之間為啟動(dòng)子活性區(qū)域。對(duì)不同細(xì)胞系中的熒光活性進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同截短體在三種細(xì)胞系中的活性依次為293T＜C2C12＜3T3-L1(P＜0.01)。lncFAM200B的啟動(dòng)子活性在3

7、T3-L1細(xì)胞中最強(qiáng)，其次是在C2C12細(xì)胞中，與lncFAM200B在肌肉、脂肪中的表達(dá)水平一致。對(duì)啟動(dòng)子活性區(qū)域結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，264bp的活性區(qū)域中有6個(gè)與肌肉發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子SP1潛在的結(jié)合位點(diǎn)，2個(gè)與脂肪發(fā)育密切相關(guān)的C/EBPα潛在的結(jié)合位點(diǎn)。這些結(jié)果提示lncFAM200B可能對(duì)牛肌肉和脂肪的發(fā)育具有一定的調(diào)控作用。
　　3.牛長(zhǎng)鏈非編碼RNA lncFAM200B基因遺傳變異及其遺傳效應(yīng)研究
　

8、　肌肉和脂肪的發(fā)育是影響個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育的主要原因，因此，本研究進(jìn)一步從群體水平上分析lncFAM200B基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)與牛生長(zhǎng)相關(guān)性狀的關(guān)系。DNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)南陽(yáng)牛lncFAM200B基因第1內(nèi)含子存在1個(gè)SNP突變(AC_000163:g.2472T＞C，TaqI);利用PCR-RFLP方法鑒定145頭南陽(yáng)牛個(gè)體的基因型，結(jié)果顯示:TC基因型的頻率最高(0.57)，CC基因型的頻率最低(0.02)。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，該遺傳變