肝細胞脂肪變性模型中Sec61α的表達及可能作用機制.pdf

1、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是全球第一大非感染性肝病,它是胰島素抵抗(IR)和遺傳易感性相關的代謝應激性肝臟損害,其主要疾病譜表現為單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、NASH相關肝硬化(NASH-LC)及肝癌。雖然“二次打擊”學說已成為解釋NAFLD的經典理論,但可能發(fā)病機制尚未闡明。
　　內質網(ER)是真核細胞中一種重要的細胞器,它主要參與蛋白質的合成、組裝、折疊、運輸、細胞內鈣的儲存,以及脂質代謝與類固醇激素

2、的合成。在缺氧、氧化應激、異常糖基化反應以及Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡等情況下,未折疊蛋白增多,超出內質網的處理能力時,可導致內質網應激(ERS)。
　　ERS分為三種類型:
　　(1)細胞核因子κB(NF-κB)引發(fā)的內質網超負荷反應(EOR);
　　(2)固醇調節(jié)級聯反應;
　　(3)未折疊蛋白反應(UPR)。在肝細胞脂肪變性過程中,ERS的調控十分重要,且內質網應激(ERS)與NAFLD的發(fā)生發(fā)展密切相關,ERS中的

3、未折疊蛋白反應(UPR)在NASH、糖尿病等代謝疾病引起的肝損害進展中起著關鍵作用。然而NAFLD如何啟動,內質網脂質負荷的增多如何引起內質網內未正確折疊蛋白的增多,肝細胞內脂質負荷過載與ERS的發(fā)生之間更直接的聯系是什么,這些問題并未得到明確回答。
　　Sec61蛋白是內質網上重要的通道蛋白,也是未折疊蛋白轉運及后續(xù)的未折疊蛋白降解途徑(ERAD)的核心結構,對ERS的平衡,維持ER復雜功能起著重要作用。它包括α、β、γ亞基,其

4、主要功能是形成疏水通道,使核糖體合成的新生多肽通過并穿過內質網的內腔,完成正確折疊。作為一種通道蛋白,Sec61是否在肝細胞脂肪變性模型中發(fā)生了變化,是否參與肝細胞脂肪變性的過程,目前尚未見報道。因此,本研究建立軟脂酸與油酸混合物體外誘導肝細胞脂肪變性模型,檢測Sec61α與內質網Ca2+密切相關的葡萄糖調節(jié)蛋白94(GRP94)、Bcl-2,以及ERS標志蛋白葡萄糖調節(jié)蛋白78(GRP78)的表達,探討Sec61α在肝細胞脂肪變性中的

5、可能作用機制。
　　方法:
　　1.應用軟脂酸與油酸混合物(PA:OA=1:2)誘導L02肝細胞發(fā)生肝細胞脂肪變性,建立非酒精性脂肪性肝病肝細胞脂肪變體外模型,分為正常對照組與脂肪變性組,分別于0h、2h、4h、8h及16h收獲細胞。
　　2.采用油紅O染色顯示肝細胞胞質內脂滴情況,利用相差倒置顯微鏡觀察其脂肪變化程度;每組肝細胞隨機選取5個視野進行采圖,并應用Image J軟件進行圖像分析,以平均脂變面積評價肝細胞脂

6、變程度。
　　3.根據L02細胞脂肪變性過程中,是否加入Sec61抑制劑EeyarestatinⅠ,將細胞分為正常對照組、脂肪變性組、Sec61抑制劑組及DMSO組。
　　4.利用qRT-PCR及Western blot檢測各時相點Sec61α、GRP78、GRP94及Bcl-2的表達變化。
　　5.采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。
　　結果:
　　1.油紅O染色評價軟脂酸與油酸混合物誘導L02肝細

7、胞脂肪變情況油紅O染色后顯微鏡下觀察,脂滴為紅色,而隨著造模時間延長,細胞質內脂滴明顯增多,逐漸融合成點片狀,并呈現逐漸增加趨勢。2 h的脂變面積為3.36±0.32,4 h為22.53±2.16,8 h為85.27±13.82,12 h253.94±21.68,16 h為427.56±29.73,均較0 h顯著升高(P<0.01)。
　　2. qRT-PCR檢測L02肝細胞脂肪變性過程中,Sec61α與GRP78的mRNA動態(tài)變

8、化水平在mRNA水平,以0 h的表達為1,Sec61αmRNA相對表達量在細胞脂肪變模型早期(2 h、4 h)出現下降(P>0.05),而在后期增加(8 h、12 h、16 h, P<0.05);GRP78的表達也呈逐漸上升態(tài)勢,8 h明顯上升(P<0.05),在12 h、24 h較0 h顯著升高(P<0.01)。
　　3.Western blot檢測L02肝細胞脂肪變性過程中,Sec61α與GRP78蛋白的動態(tài)變化水平在蛋白水平

9、上,Sec61α在肝細胞脂肪變性早期下降(2 h,4 h,P>0.05),晚期升高(8 h,12h,P<0.05)的變化規(guī)律;GRP78蛋白表達呈逐漸上升的變化規(guī)律(P<0.05)。
　　4.油紅O染色評價應用Sec61抑制劑 EeyarestatinⅠ處理后,肝細胞脂肪變性程度油紅O染色后顯微鏡下觀察,DMSO組與脂肪變性組的脂變面積差異不明顯,無統(tǒng)計學意義(P>0.05),而抑制劑組與脂肪變性組的脂變面積差異明顯(P<0.01

10、)。
　　5.Western blot檢測應用Sec61抑制劑后各組蛋白表達變化在蛋白水平,脂肪變性組與 DMSO組比較,無統(tǒng)計學差異(P>0.05),而抑制劑組中 Sec61α與 GRP78蛋白水平與脂肪變性組相比,明顯降低(P<0.01);GRP94與Bcl-2則明顯升高(P<0.01)。
　　結論:
　　1.應用軟脂酸與油酸混合物可成功建立肝細胞脂肪變性體外模型,且隨時間延長,肝細胞胞質中脂滴面積也不斷增加。

11、r>　　2.內質網應激貫穿于肝細胞脂肪變的整個過程,隨時間延長,ERS逐漸加重。
　　3.內質網孔道蛋白Sec61在肝細胞脂肪變性過程中的早期(2 h,4 h)先下降,此時ERS雖有發(fā)生,但程度較輕,Sec61的變化可能是一種適應性變化。在肝細胞脂肪變后期(8 h,12 h,16 h),Sec61隨ERS進一步加重,表達逐漸升高。在加入Sec61抑制劑后,ERS明顯減輕,肝細胞脂肪變性程度同步減輕,提示在肝細胞脂肪變性過程中, S