血管性癡呆小鼠海馬組織乙酰膽堿代謝變化及喜得鎮(zhèn)影響的研究.pdf

1、目的：血管性癡呆(vasculardementia，VD)是由各種腦血管疾病導(dǎo)致的獲得性、持續(xù)性智能障礙綜合征，是老年期癡呆的主要類(lèi)型。明顯的，進(jìn)行性的學(xué)習(xí)記憶能力的損害是VD的主要臨床癥狀，至今對(duì)其尚無(wú)有效的防治措施。隨著社會(huì)人口的日益老齡化和腦血管病發(fā)病率的不斷上升，VD的發(fā)病呈迅速增長(zhǎng)趨勢(shì)，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。目前認(rèn)為，慢性腦灌注不足是VD的主要原因，海馬的膽堿能系統(tǒng)與認(rèn)知功能直接相關(guān)。海馬是大腦的一個(gè)重要結(jié)構(gòu)，在學(xué)習(xí)和記

2、憶中起著重要的作用，隔內(nèi)側(cè)核和Broca斜角帶核的膽堿能神經(jīng)元是海馬膽堿能纖維的主要來(lái)源，其釋放遞質(zhì)乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)至海馬，參與學(xué)習(xí)、記憶的形成。腦組織缺血缺氧，導(dǎo)致海馬神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量減少和功能障礙，影響膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AchE)和膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(cholineacetyltransferase，ChAT)的分布與含量，從而引起Ach的改變。作為改善智能障礙的一線(xiàn)藥物，喜

3、得鎮(zhèn)(hydergine，化學(xué)名：甲磺酸二氫麥角堿)已廣泛應(yīng)用于VD的治療，但其治療VD的藥理機(jī)制卻尚在探討中。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立VD模型，觀察其海馬AchE和ChAT的變化，探討VD發(fā)病的膽堿能機(jī)制及喜得鎮(zhèn)改善智能，提高VD患者學(xué)習(xí)、記憶的膽堿能藥理機(jī)制。 方法：本研究分為三部分。第一部分以昆明小鼠為研究對(duì)象，采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈絲線(xiàn)結(jié)扎方法、經(jīng)連續(xù)三次反復(fù)缺血-再灌注，制備VD模型，并設(shè)立假手術(shù)組、藥物組(喜得鎮(zhèn))；造模術(shù)后第29、

4、30d，利用跳臺(tái)試驗(yàn)和水迷宮試驗(yàn)對(duì)各組小鼠分別進(jìn)行學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)測(cè)試，并觀察各組小鼠行為學(xué)差異。第二部分采用迅速取材，4％多聚甲醛溶液固定的小鼠腦組織為研究對(duì)象，分別用免疫組化和原位雜交技術(shù)，在光鏡下觀察各組小鼠海馬組織ChAT和ChATmRNA的表達(dá)變化，并且計(jì)算其海馬CA1區(qū)ChAT和ChATmRNA陽(yáng)性細(xì)胞的面密度值，比較各組海馬的表達(dá)是否差異。第三部分以采用快速取材、分離低溫保存的海馬組織作為研究對(duì)象，比較各組小鼠海馬AchE活

5、性有無(wú)差別。 結(jié)果：(1)跳臺(tái)試驗(yàn)：模型組小鼠學(xué)習(xí)、記憶成績(jī)顯著下降，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)階段的反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)(P＜0.01)、錯(cuò)誤次數(shù)增加(P＜0.01)，記憶階段的潛伏時(shí)間縮短(P＜0.01)、錯(cuò)誤次數(shù)增加(P＜0.01)；藥物組較模型組學(xué)習(xí)、記憶成績(jī)明顯改善(P＜0.01)，并且與假手術(shù)組比較無(wú)差別(P＞0.05)。(2)水迷宮試驗(yàn)：模型組小鼠學(xué)習(xí)、記憶成績(jī)也顯著下降，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)階段的游全程時(shí)間延長(zhǎng)和錯(cuò)誤次數(shù)增加(P＜0.01)，記憶

6、階段的游全程時(shí)間延長(zhǎng)和錯(cuò)誤次數(shù)增加(P＜0.01)；藥物組較模型組明顯改善(P＜0.01)，并且與假手術(shù)組之間無(wú)差別(P＞0.05)。(3)海馬硫堇染色：假手術(shù)組海馬硫堇染色顯示海馬輪廓清楚、錐體細(xì)胞3-5層，數(shù)量豐富，排列規(guī)則致密，細(xì)胞核圓而大，核仁清晰，胞漿內(nèi)尼氏體豐富，神經(jīng)纖維密集；模型組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞層次減少，排列松散，錐體細(xì)胞數(shù)目減少，胞漿內(nèi)尼氏體減少甚至消失，細(xì)胞核體積變小，深染，結(jié)構(gòu)不清，呈核固縮表現(xiàn)，神經(jīng)纖維排列紊

7、亂；而藥物組病理改變明顯減輕。(4)海馬ChAT及其mRNA的表達(dá)變化：在光鏡下，假手術(shù)組海馬CA1區(qū)層次清楚，有大量的陽(yáng)性神經(jīng)元，排列緊密，呈棕黃色，胞體較大，圓形或橢圓形，有的可見(jiàn)突起。而模型組陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，排列松散，染色較淡。藥物組可見(jiàn)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目較模型組增多，排列較緊密，染色變深。經(jīng)過(guò)計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞面密度值發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠海馬ChAT及其mRNA的陽(yáng)性神經(jīng)元面密度值降低(P＜0.01)，而藥物組ChAT

8、及其mRNA的陽(yáng)性神經(jīng)元面密度值增加，與模型組比較有差別(P＜0.01)，并且與假手術(shù)組無(wú)差別(P＞0.05)。(5)海馬AchE活性：與假手術(shù)組相比，模型組小鼠海馬組織AchE活性顯著降低(P＜0.01)，而藥物組與模型組比較，AchE活則明顯升高(P＜0.05)。 結(jié)論：(1)本實(shí)驗(yàn)成功地建立了小鼠VD模型，經(jīng)過(guò)跳臺(tái)試驗(yàn)、水迷宮試驗(yàn)證實(shí)了VD小鼠存在學(xué)習(xí)和記憶能力障礙，能夠基本模擬臨床上VD的智能障礙，海馬硫堇染色顯示海馬錐

9、體細(xì)胞受損，是比較理想的VD動(dòng)物模型；同時(shí)，也證實(shí)了喜得鎮(zhèn)的治療效果。(2)采用免疫組化和原位雜交技術(shù)，證實(shí)了海馬組織ChAT及其mRNA的表達(dá)減少參與了VD的認(rèn)知功能損害；喜得鎮(zhèn)可以通過(guò)促進(jìn)海馬ChAT、ChATmRNA的表達(dá)，增加Ach的合成，進(jìn)而提高Ach含量而改善VD的臨床癥狀。(3)運(yùn)用Beckman全自動(dòng)生化分析儀，證實(shí)了海馬AchE活性降低參與了VD的發(fā)?。幌驳面?zhèn)可以升高VD小鼠海馬AchE活性，反映了膽堿能系統(tǒng)功能的改善