凋亡素修飾的骨髓間充質干細胞對肝癌細胞的體外抑制作用研究.pdf

1、目的:肝癌是全球癌癥第三號殺手，術后復發(fā)轉移率很高，這成為肝癌臨床治療的難題。干細胞治療是目前正在探索的腫瘤新型生物治療方法之一。間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)由于能夠向腫瘤遷移、免疫原性低等特性有望成為抗腫瘤因子靶向治療的理想載體;凋亡素具有對正常細胞無毒性的廣譜抗腫瘤特性;腺病毒載體具有毒性低、轉基因持續(xù)表達等優(yōu)點。但目前將MSCs、腺病毒及凋亡素聯(lián)合應用于肝癌抑制作用的研究尚未見報道。本論文

2、構建表達凋亡素的腺病毒并感染人骨髓MSCs，通過一系列實驗，探索MSCs向肝癌細胞的遷移及其腺病毒載體介導的凋亡素修飾的MSCs對肝癌細胞的體外抑制作用。本研究的開展探討了癌癥的干細胞療法，為癌癥的臨床治療提供新的途徑與實驗依據。同時為干細胞為載體的新型體內給藥系統(tǒng)的研究奠定基礎，有望解決腺病毒載體直接遞送藥物引起的免疫排斥問題。
　　方法:首先，利用transwell進行MSCs與HepG2共培養(yǎng)，檢測MSCs向肝癌細胞HepG

3、2的遷移能力。其次，根據GeneBank上登錄的凋亡素Apoptin(vp3)基因序列，全基因合成vp3，經過修飾后獲得凋亡素的編碼基因為466bp;將vp3基因插入穿梭載體pAd-Track-CMV（含有GFP基因），獲得穿梭質粒pAdTrack-CMV-vp3;利用PmeⅠ線性化上述鑒定成功的質粒，并轉化含有腺病毒骨架質粒pAdEasy-1的RecA+E.coli BJ5183感受態(tài)細胞，構建pAd-vp3重組質粒，并通過限制性內切

4、酶方法鑒定分析;PacⅠ消化pAd-vp3去除抗性基因及原核復制元件，獲得重組腺病毒Ad-vp3;隨后轉染293細胞并擴增，獲得高滴度的病毒顆粒。利用此高滴度的病毒顆粒感染MSCs，收集病毒顆粒感染后的MSCs培養(yǎng)上清，利用Western Blot檢測凋亡素的表達，從而獲得表達凋亡素蛋白的MSCs;收集穩(wěn)定表達凋亡素的MSCs的條件培養(yǎng)基作用于HepG2，同時將穩(wěn)定表達凋亡素的MSCs和HepG2共培養(yǎng)，檢測對HepG2的抑制作用。

5、r>　　結果:通過遷移實驗證明，MSCs具有明顯向肝癌細胞HepG2遷移的能力(P＜0.01);成功構建了可表達凋亡素Apoptin的重組腺病毒Ad-vp3，感染293細胞，獲得了高滴度（1.0×1012 pfu/mL）的病毒顆粒，提取病毒基因組，檢測到凋亡素基因的存在，證明符合構建目的;高滴度的病毒顆粒感染MSCs后，利用Western Blot檢測發(fā)現感染后的MSCs培養(yǎng)上清中有凋亡素的表達，從而獲得表達凋亡素蛋白的MSCs;體外抑

6、制實驗表明，穩(wěn)定表達凋亡素的MSCs和HepG2共培養(yǎng)后，表達凋亡素的MSCs可以顯著抑制HepG2的增殖(P＜0.01)。同時，穩(wěn)定表達凋亡素的MSCs的條件培養(yǎng)基也可以明顯抑制HepG2的增殖(P＜0.05)，但對正常細胞沒有抑制作用。
　　結論:本實驗成功地利用腺病毒系統(tǒng)構建了重組腺病毒Ad-vp3，感染MSCs獲得了表達凋亡素的MSCs，并證明經凋亡素修飾的MSCs及其條件培養(yǎng)基均可以明顯抑制HepG2的增殖，為探討癌癥的