COX-2反義RNA與NSAIDs抑制膀胱癌細(xì)胞惡性表型的實驗研究.pdf

1、膀胱移行細(xì)胞癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的腫瘤，特點是極易復(fù)發(fā)，對放療及化療不敏感，而且化療藥物不能阻止膀胱癌的進(jìn)展。目前腫瘤綜合治療是抗瘤治療的方向，它可使腫瘤治療的療效比單純外科治療明顯提高，同時探索腫瘤治療的新途徑一直為人們所重視。 環(huán)氧合酶(COX)是花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素(PG)和血栓烷(TXA2)的關(guān)鍵限速酶，COX-2是兩種亞型之一，是高誘導(dǎo)基因，可被一些細(xì)胞因子、生長因子、腫瘤促進(jìn)因子、癌基因和化學(xué)致癌物激活，被認(rèn)為有

2、導(dǎo)致腫瘤和炎癥的作用。大量研究表明，環(huán)氧化酶-2在食管癌、胃癌、大腸癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌等中有較高表達(dá)，并認(rèn)為參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。 流行病學(xué)研究顯示規(guī)律的服用非甾體抗炎藥物(NSAIDs)可降低結(jié)腸癌的危險性，其機(jī)制可能與抑制COX-2表達(dá)有關(guān)。塞來昔布(Celecoxib)是COX-2選擇性抑制劑，是唯一經(jīng)過FDA認(rèn)證的可以用于家族性腺瘤息肉病的治療，但其防治腫瘤的作用機(jī)制仍然沒有完全清楚。 本

3、研究旨在探討人COX-2反義RNA及NSAIDs抑制膀胱癌細(xì)胞惡性表型的作用及其機(jī)制，以期為臨床制定腫瘤的治療方案提供理論依據(jù)。本實驗應(yīng)用基因重組技術(shù)、反義核酸技術(shù)、基因轉(zhuǎn)染技術(shù)、MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、RT-PCR、Westernblot、激光共聚焦技術(shù)及裸鼠成瘤實驗，對體內(nèi)外膀胱癌細(xì)胞增殖與凋亡，及其與COX-2蛋白表達(dá)的相關(guān)性等進(jìn)行了研究。為進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用NSAIDs打下了實驗基礎(chǔ)，主要實驗內(nèi)容及結(jié)果如下： 1、COX-2

4、反義RNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞株通過PCR方法從含有人COX-2基因的質(zhì)粒中擴(kuò)增COX-2cDNA，并通過限制性內(nèi)切酶克隆于T載體(pMD18-T)EcoRⅠ和XbaⅠ位點之間，測序正確后，雙酶切獲得COX-2cDNA，并將其反向插入pcDNA3.1中完成質(zhì)粒的重組。重組質(zhì)粒命名為pcDNA3.1/COX-2as，并通過核酸測序和限制性內(nèi)切酶消化證實重組反義COX-2真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/COX-2as正確的。

5、 應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，將pcDNA3.1/COX-2as質(zhì)粒導(dǎo)入T24膀胱癌細(xì)胞中。經(jīng)過G418的篩選，選出陽性克隆進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)、間接免疫熒光染色和RT-PCR鑒定。經(jīng)3種方法的鑒定，在轉(zhuǎn)導(dǎo)pcDNA3/COX-2as的T24細(xì)胞中COX-2的表達(dá)明顯抑制，提示反義COX-2RNA成功的導(dǎo)入了T24細(xì)胞中并顯著的抑制了COX-2的活性，成功的制備了COX-2基因表達(dá)持續(xù)下調(diào)的膀胱腫瘤細(xì)胞株T24-AS。 2、C

6、OX-2反義RNA及NSAIDs抑制膀胱癌細(xì)胞惡性表型的實驗研究①實驗方法：應(yīng)用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)對研究了NSAIDs對膀胱腫瘤T24及T24-AS細(xì)胞株體外抗增殖活性及細(xì)胞周期的影響。應(yīng)用RT-PCR檢測了膀胱腫瘤T24及T24-AS細(xì)胞株凋亡相關(guān)因子Bcl-2、bax、Bak、bcl-xl及凋亡相關(guān)蛋白survivinmRNA表達(dá)。應(yīng)用流式細(xì)胞儀(AnnexinV-FITC和PI熒光染色)檢測NSAIDs對膀胱腫瘤T24及T24-

7、AS細(xì)胞株早期凋亡的影響。應(yīng)用Westernblot檢測NSAIDs對膀胱腫瘤T24及T24-AS細(xì)胞株COX-2蛋白表達(dá)的影響。 ②結(jié)果：膀胱癌T24-AS較T24細(xì)胞株增殖活性明顯受到抑制，提示COX-2表達(dá)與腫瘤細(xì)胞增殖呈正相關(guān)；IN和Celecoxib對膀胱癌細(xì)胞均有明顯的抗增殖作用，并能使細(xì)胞周期G0/G1期比例明顯升高，而塞來昔布對T24-AS的作用最強(qiáng)。膀胱T24及T24-AS細(xì)胞株凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax、

8、Bak、Bcl-xl表達(dá)無明顯差異，與流式細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)T24及T24-AS凋亡率無明顯差異相吻合，說明COX-2表達(dá)水平與細(xì)胞增殖活性相關(guān)，而與細(xì)胞凋亡無明顯相關(guān)性。IN和Celecoxib對膀胱腫瘤T24及T24-AS細(xì)胞株具有明顯促進(jìn)其凋亡的作用，存在劑量依賴性，選擇性COX-2抑制劑Celecoxib作用更強(qiáng)。膀胱腫瘤T24-AS較T24細(xì)胞株COX-2蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，但I(xiàn)N和Celecoxib能更進(jìn)一步的抑制其表達(dá)，Celec

9、oxib作用更強(qiáng)，說明選擇性和非選擇性COX-2抑制劑均有相同的抑制COX-2表達(dá)的作用。選擇性和非選擇性COX-2抑制劑對膀胱癌細(xì)胞有明顯的抗增殖和促進(jìn)凋亡作用，其促進(jìn)凋亡作用與COX-2表達(dá)無明顯相關(guān)性，其促進(jìn)凋亡作用可能主要是通過COX-2非依賴性途徑完成的。Celecoxib對膀胱癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的抗增殖和促進(jìn)凋亡作用。 3、COX-2與NSAIDs對膀胱癌細(xì)胞株裸鼠成瘤作用的影響①實驗方法：裸鼠成瘤性實驗，觀察NSAID

10、s對裸鼠成瘤性的影響；應(yīng)用免疫組化、RT-PCR、westernblot技術(shù)以及形態(tài)學(xué)檢測移植瘤凋亡與COX-2表達(dá)。 ②結(jié)果：本實驗主要研究了COX-2及NSAIDs在體內(nèi)對膀胱癌細(xì)胞株的作用。NSAIDs干預(yù)組與T24-AS組裸鼠移植瘤中COX-2表達(dá)明顯降低；NSAIDs和COX-2反義RNA能抑制膀胱癌T24細(xì)胞株裸鼠移植瘤的生長，IN和Celecoxib對裸鼠移植瘤成瘤均有抑制作用，而Celecoxib作用更強(qiáng)；光鏡與

11、電鏡顯示T24-AS組與NSAIDs藥物干預(yù)組腫瘤細(xì)胞凋亡明顯增加；IN和Celecoxib對裸鼠移植瘤生長的作用可能是通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖與促進(jìn)其凋亡。 綜上所述，我們探討了COX-2反義RNA與NSAIDs在體內(nèi)外抑制膀胱癌細(xì)胞惡性表型，結(jié)論如下： 一、膀胱癌細(xì)胞COX-2基因表達(dá)下調(diào)及NSAIDs的干預(yù)能明顯抑制細(xì)胞增殖活性，COX-2表達(dá)與細(xì)胞增殖活性呈正相關(guān)關(guān)系，而與細(xì)胞凋亡無明顯相關(guān)性。 二、細(xì)胞與在

12、體實驗均證實IN和Celecoxib對膀胱腫瘤T24及T24-AS細(xì)胞株具有明顯促進(jìn)其凋亡的作用，存在劑量依賴性，Celecoxib作用更強(qiáng)。 三、細(xì)胞與在體實驗均證實IN和Celecoxib能進(jìn)一步抑制膀胱腫瘤T24-AS的COX-2表達(dá)，對其有雙重阻斷作用。 四、選擇性和非選擇性COX-2抑制劑對膀胱癌細(xì)胞有明顯的抗增殖和促進(jìn)凋亡作用，其促進(jìn)凋亡作用與COX-2表達(dá)高低無明顯相關(guān)性，提示主要是通過COX-2非依賴性途