腎小管上皮細胞轉分化在DN發(fā)病中的作用及大黃酸對其影響的研究.pdf

1、背景及目的: 腎小管間質病變是糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)進展為終末期腎臟病(ESRD)的重要病理基礎，細胞外基質(ECM)在腎間質過量堆積是其基本病理特征。目前認為腎間質ECM主要由肌成纖維細胞(MyoF)分泌。研究發(fā)現(xiàn)在病理條件下，腎小管上皮細胞可發(fā)生上皮細胞—肌成纖維細胞轉分化(Epithelial-myofibroblasttransdifferentiation，EMT)，即喪失原有的上

2、皮細胞表型特征，而獲得MyoF 的新特征，是腎間質MyoF的重要來源。有研究報道，在單側輸尿管梗阻(UUO)模型大鼠，EMT參與了腎間質纖維化的發(fā)生與發(fā)展。但在DN腎小管間質病變進程中，是否也存在上述EMT過程尚不清楚。 轉化生長因子-β<,1>(TGF-β<,1>)是EMT的重要啟動和促進因子。TGF-β<,1>的生物學作用廣泛而復雜，具有正面和負面的多樣效應。單純抑制TGF-β<,1>這一上游因子，則可能在抑制EMT的同時引

3、起其他不利的負效應。于是，尋找作用更特異、有效的下游因子或環(huán)節(jié)，成為新近研究的關注熱點。整合素連接激酶(Integrin-linked kinase，ILK)是新近發(fā)現(xiàn)的一種與整合素細胞內區(qū)域結合的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，已有研究證實ILK是整合素、生長因子、MAPK及Wnt等多個信號傳導通路的交叉點和重要效應物。以往對ILK的研究主要集中在腎小球，近年在UUO模型大鼠和體外細胞培養(yǎng)的研究結果表明，腎間質ECM的聚積與ILK表達正相關；

4、 ILK介導TGF-β<,1>/Smad信號傳導通路，可能參與腎小管EMT過程。然而，在DN腎小管上皮細胞中ILK表達情況及其與EMT關系，目前所知尚少。 人們一直在努力尋找能有效阻抑腎間質纖維化的藥物。大黃是臨床治療慢性腎臟病處方使用頻率很高的一味中藥。大黃酸(Rhein)是從大黃蒽醌衍生物中分離出的一種前體組分，為大黃的主要有效成分。臨床與實驗研究結果均表明大黃酸能有效減緩慢性腎臟病進程，具有肯定的腎臟保護作用。但大黃酸對D

5、N的小管間質病變及EMT過程的作用、影響，尚少見報道。本研究擬從糖尿病大鼠模型和體外細胞培養(yǎng)兩個實驗層面，采用反映上皮細胞表型特征的E鈣粘素(E-Cadherin)、反映MyoF表型特征的α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和作為ECM成分的纖維連接蛋白(FN)等指標，觀察在DN小管間質病變中，腎小管上皮細胞轉分化與ILK表達的改變，以及EMT與ILK的關系；并用大黃酸干預處理，觀察大黃酸對上述過程的影響。旨在從EMT這一新途徑，探討DN病變

6、進展新機制，尋找DN防治的新靶點。 方法: (一)動物實驗部分 雄性Wistar大鼠隨機分為正常對照組(N組，n=12)、糖尿病模型組(D組，n=12)和糖尿病大黃酸干預組(R組，n=12)。采用腹腔內一次注射 STZ 55mg·kg<'-1>誘導糖尿病模型。大黃酸組大鼠于糖尿病成模后，給予大黃酸100mg·kg<'-1>·d<'-1>灌胃。分別于第8、16周末，每組隨機選取6只大鼠，留24小時尿測定尿蛋白排泄量

7、；處死大鼠，心臟取血測血清肌酐(SCr)、血甘油三酯(TG)和膽固醇(CH)；腎臟原位灌洗后，取腎組織：石蠟切片，HE和Masson染色觀察腎小管間質損害及纖維化；免疫組化法檢測腎小管上皮細胞E-Cadherin、α-SMA、FN與ILK的表達；免疫印跡方法檢測腎組織E-Cadherin、α-SMA、FN與ILK蛋白的表達。 (二)細胞實驗部分 應用細胞培養(yǎng)技術，按下列實驗條件分組培養(yǎng)人近端腎小管上皮細胞(HK-2)：空

8、白對照(N組)，低糖(5.5mmol/L)DMEM培養(yǎng)基；高糖(D組)葡萄糖濃度30mmol/L；高糖+大黃酸25μg/ml(R-25組)；高糖+大黃酸50μg/ml(R-50組)；高糖+大黃酸100μg/ml(R-100組)。分別于24h、48h、72h收集各組細胞，免疫印跡方法檢測E-Cadherin、α-SMA、FN與ILK的蛋白表達。結果: 1.D組和R組糖尿病大鼠的尿蛋白量、血清肌酐值與腎小管間質損傷指數(shù)、間質膠原相對

9、面積等均隨病程進展而增加，明顯高于同期N組(P<0.01)；大黃酸(R組)能減輕上述病變。16周時R組較同期D組，其腎臟保護作用更顯著(P<0.05)。 2.D組和R組糖尿病大鼠腎小管上皮細胞：E-Cadherin表達隨病程逐漸減少(P<0.05)，而α-SMA、FN表達逐漸增加，均較同期N組有顯著差異(P<0.05，P<0.01)；同時，ILK表達也明顯上調(P<0.05)。ILK與E-Cadherin呈負相關(r<,s>=-

10、0.82，P<0.05)，與α-SMA、FN 呈正相關(r<,s>=0.83，P<0.05；r<,s>=0.94，P<0.01；)。大黃酸干預可改善上述變化，16周時R組較同期D組各指標的改善呈現(xiàn)顯著差異(P<0.01)。 3.高糖環(huán)境下HK-2細胞(D組)與N組比較，E-Cadherin的蛋白表達減少(P<0.05)；ILK、α-SMA、FN蛋白的表達增多(P<0.05)。經(jīng)大黃酸處理后的各R組與D組比較E-Cadherin的

11、蛋白表達上調(P<0.05)，α-SMA、FN及ILK、蛋白表達下調(P<0.05)，且與大黃酸呈劑量、時間依賴性關系(P<0.05)。 結論: 1. 高糖環(huán)境下HK-2細胞與糖尿病大鼠腎小管上皮細胞，E-cadherin表達減少，α-SMA、FN表達增加，表明DN腎小管間質病變進程中，存在腎小管上皮細胞轉分化(EMT)，成為MyoF的重要來源。 2.在DN病理狀態(tài)下，腎小管上皮細胞呈現(xiàn)ILK高表達，且與EMT過