Slug對肝癌細胞干細胞特性及VM形成影響的研究.pdf

1、[研究目的]
　　 腫瘤血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry，VM)是一種特殊的供養(yǎng)模式，它的管壁是由腫瘤細胞構(gòu)成的。VM與腫瘤的臨床分期、浸潤和轉(zhuǎn)移、患者生存期的縮短有關(guān)。Slug是重要的EMT調(diào)控因子，它不僅能誘導EMT的發(fā)生還能夠影響腫瘤干細胞的干細胞特性。腫瘤干細胞可以促進腫瘤血管生成，同時它還具有向內(nèi)皮細胞分化的能力。然而，到目前為止在HCC中EMT、CSCs和VM三者之間的關(guān)系還不是很明確。本研究通

2、過對113例隨訪資料完整的人類肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)臨床病例資料進行分析，研究Slug和E-cadherin、vimentin、VE-cadherin、VEGF、CD90和CD133等之間的關(guān)系，分析Slug對HCC復發(fā)轉(zhuǎn)移、預后生存、腫瘤干細胞表型表達的影響以及其在腫瘤血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry，VM)中的作用。利用裸鼠模型和HCC細胞系在體內(nèi)和體外實驗中對臨

3、床病例資料的結(jié)果進行驗證。期待能為HCC的治療提供新的靶點。
　　 [研究方法]
　　 1、收集天津醫(yī)科大學總醫(yī)院和附屬腫瘤醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除標本隨訪資料完整并經(jīng)病理診斷為肝細胞肝癌的病例113例，分為Slug陽性組與Slug陰性組，分析Slug與年齡、性別、復發(fā)與轉(zhuǎn)移，臨床分期之間的關(guān)系;運用Kaplan-Meier生存分析比較兩組患者的生存預后情況。
　　 2、篩選出低表達和高表達Slug的HCC細胞系，構(gòu)建Sl

4、ug表達質(zhì)粒和shRNA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細胞獲得Slug上調(diào)和下調(diào)模型，用Western blot鑒定轉(zhuǎn)染效果。利用Transwell侵襲實驗評價Slug對細胞遷移和侵襲能力的影響;進一步利用三維培養(yǎng)模型分析Slug在腫瘤細胞血管生成過程中的作用;利用染色質(zhì)免疫共沉淀和基因芯片分析Slug的調(diào)控作用和信號轉(zhuǎn)導通路。
　　 3、利用5周齡的雄性BALB/c裸鼠建立動物模型。分為Slug陽性組和Slug陰性組，在每只裸鼠腋下分別注入5X1

5、06個HepG2-Slug和HepG2腫瘤細胞。每周測量裸鼠腫瘤的大小并計算腫瘤的體積，成瘤一個月后處死裸鼠。腫瘤體積計算用公式為TV=1/2×a×b2（a為腫瘤的長，b為腫瘤的寬）。分析Slug在VM的形成和調(diào)節(jié)E-cadherin、vimentin、VE-cadherin、VEGF、CD90和CD133等蛋白表達水平中的作用。
　　 [結(jié)果]
　　 1、Slug的表達與VM的形成相關(guān)
　　 VM是由腫瘤細胞模

6、仿血管壁的結(jié)構(gòu)形成的可輸送血液的管道系統(tǒng)，CD31/PAS雙染可以觀察到腫瘤細胞CD31表達陰性，一層厚薄不一的PAS陽性物質(zhì)圍繞在該管道的結(jié)構(gòu)外周形成類似基底膜樣的結(jié)構(gòu)，管道中央有紅細胞的存在。113例HCC臨床病例樣本，發(fā)現(xiàn)20例(20/113，17.7％)具有典型的VM結(jié)構(gòu)。尋找熱點區(qū)域，然后在高倍鏡(200x)計數(shù)VM的個數(shù)，計數(shù)5個視野取平均值。Slug陽性組VM計數(shù)（4.20±0.80）大于Slug陰性組VM計數(shù)（0.18±

7、0.12），兩組VM計數(shù)之間的差異具有統(tǒng)計學意義(t=6.662，p=0.000)。提示在肝癌病例中Slug表達與VM的形成相關(guān)。
　　 Slug陽性細胞可以參與形成血管生成擬態(tài)或與內(nèi)皮細胞共同形成馬賽克血管，它與腫瘤血管的形成密切相關(guān)。Hepatocyte免疫組織化學染色結(jié)果顯示形成VM的細胞為HCC腫瘤細胞，而且Hepatocyte陽性細胞和Hepatocyte/Slug陽性細胞參與了腫瘤VM的形成。
　　 VE-c

8、adherin是公認的VM形成的標志性分子。免疫組織化學染色結(jié)果顯示，在113例HCC臨床病例資料中，VE-cadherin表達的陽性率為42.5％(48/113)。統(tǒng)計學分析表明，Slug的表達與VE-cadherin的表達具有相關(guān)性。VEGF表達的陽性率為61.1％(69/113)。Slug陽性組VEGF的表達明顯強于Slug陰性組，差異具有統(tǒng)計學意義，相關(guān)分析表明Slug的表達與VEGF的表達呈正相關(guān)。
　　 2、Slug

9、的表達與HCC的轉(zhuǎn)移和患者的預后相關(guān)
　　 臨床病理資料分析結(jié)果顯示，slug陽性病例（39例）與Slug陰性病例(74例)相比Slug的表達與年齡、性別、臨床分期、病理分級等無關(guān)，與轉(zhuǎn)移有關(guān)。113例HCC臨床病例資料中轉(zhuǎn)移組為47例，非轉(zhuǎn)移組為66例。轉(zhuǎn)移組Slug陽性率(22/47，46.8％)高于非轉(zhuǎn)移組Slug陽性率(17/66，25.8％)，差異有統(tǒng)計學意義(X2=5.382，p=0.020)。Kaplan-Meie

10、r生存分析結(jié)果表明在HCC中表達Slug的患者生存期短、預后差，Slug陽性組病人的平均生存時間34.311（95％置信區(qū)間:27.084-41.538）較Slug陰性組病人的平均生存時間44.721個月（95％置信區(qū)間:38.192-51.251）短，差異具有統(tǒng)計學意義(p=0.025)。
　　 3、Slug能夠誘導EMT的發(fā)生
　　 Slug是公認的EMT誘導因子，它可以抑制E-cadherin的表達。免疫組化檢測E

11、-cadherin和vimentin的表達并進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示Slug的表達與E-cadherin和vimentin的表達密切相關(guān)。Slug能夠抑制E-cadherin的表達并促進vimentin的表達。免疫組織化學雙重染色結(jié)果顯示Slug陽性細胞其E-cadherin的表達缺失，而Slug陰性細胞的細胞膜則有E-cadherin的表達。
　　 4、Slug的表達與腫瘤細胞的干性特征相關(guān)
　　 CD133和CD90是

12、HCC腫瘤干細胞的標記物。統(tǒng)計學分析表明，Slug的表達與CD90的表達相關(guān)(r=0.207，P=0.028)。高表達Slug的患者也高表達CD90(30.8％，12/39)，然而低表達Slug的患者只有1.4％(10/74)的患者CD90陽性。這些實驗數(shù)據(jù)提示，Slug的表達和CSCs表面標記分子CD90的表達密切相關(guān)。免疫組織化學雙重染色結(jié)果顯示CD90陽性細胞為HCC腫瘤細胞，而且CD90和hepatocyte雙陽性的HCC細胞參

13、與了VM的形成。在HCC細胞中，Slug可以和CD90、CD133共表達于同一個腫瘤細胞，CD133和CD90陽性細胞直接參與了VM的形成。提示表達CSCs表面標記物CD133/CD90的HCC腫瘤細胞可以形成VM。
　　 免疫組織化學染色方法檢測多潛能腫瘤干細胞重編程轉(zhuǎn)錄因子sox2，nanog，oct-4的表達情況。陽性細胞均為核著色。113例HCC臨床病例資料分析結(jié)果顯示，SOX2的陽性率為29.2％，Nanog的陽性率為

14、13.3％，HCC幾乎不表達OCT4。Slug的表達和SOX2的表達具有相關(guān)性(r=0.230，P=0.014)，slug的表達同樣和nanog的表達密切相關(guān)(r=0.210，P=0.026)。研究發(fā)現(xiàn)SOX2陽性細胞參與了血管的形成。免疫組織化學雙重染色結(jié)果顯示，Slug可以和SOX2共表達于同一個腫瘤細胞，而且Slug和SOX2共表達的腫瘤細胞參與了VM的形成。在體外和體內(nèi)實驗中，這些實驗結(jié)果均得到了驗證。
　　 [結(jié)論]<

15、br>　　 1、人HCC中存在VM，VM是腫瘤細胞為適應(yīng)環(huán)境而產(chǎn)生的一種獨特的血液供應(yīng)模式，與內(nèi)皮依賴性血管并存于腫瘤組織內(nèi)，且VM結(jié)構(gòu)主要存在于分化差、惡性度高的實體型及低分化型的HCC中，提示這種結(jié)構(gòu)與HCC惡性生物學行為相關(guān)。
　　 2、EMT調(diào)控因子Slug與人HCC腫瘤的轉(zhuǎn)移及VM的形成正相關(guān)，與年齡、性別、臨床分期、病理分級等無關(guān)。它能夠影響病人的生存預后。Slug表達陽性的病人生存時間短、預后差。