RNA干擾對系統(tǒng)性硬皮病成纖維細胞CTGF表達、膠原Ⅰ、Ⅲ合成的影響.pdf

1、第一部分：CTGF-siRNA的體外轉(zhuǎn)錄合成及瞬時轉(zhuǎn)染效率的研究 目的研究針對結締組織生長因子(connectivetissuegrowthfactor，CTGF)的特異性小干擾RNA(smallinterferenceRNA，siRNA)的體外轉(zhuǎn)錄合成及其對系統(tǒng)性硬皮病(SystemicSclerosis，SSC)成纖維細胞的瞬時轉(zhuǎn)染效率。 方法取SSC患者皮膚進行成纖維細胞的原代培養(yǎng)，用角蛋白和波形蛋白染色進行成纖維

2、細胞的鑒定。設計四個針對CTGF的特異性siRNA及一個非特異性siRNA；體外轉(zhuǎn)錄獲得siRNA；并用熒光素FAM標記；用轉(zhuǎn)染試劑siPORTAmine將siRNA轉(zhuǎn)染成纖維細胞，轉(zhuǎn)染24小時后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。 結論用體外轉(zhuǎn)錄法合成siRNA簡易、高效，便于siRNA的篩選；使用專門的轉(zhuǎn)染試劑盒不但操作簡便，且能使siRNA得到高效轉(zhuǎn)染。 第二部分：CTGF-siRNA對SSC成纖維細胞CTGF表達的影響

3、 目的研究CTGF-siRNA所誘導的RNA干擾對SSC成纖維細胞CTGFmRNA和蛋白表達水平的影響。 方法CTGF-siRNA轉(zhuǎn)染48小時后，分別用半定量RT-PCR(Reversetranscriptionpolymerasechainreaction)、real-timeRT-PCR法檢測CTGFmRNA的表達并用Western-blot檢測CTGF蛋白量的變化。 結論siRNA742等四個CTGF-siR

4、NA能顯著抑制SSC成纖維細胞CTGF的表達。 第三部分：CTGF-siRNA對SSC成纖維細胞膠原Ⅰ、Ⅲ合成的影響 目的利用體外轉(zhuǎn)錄合成的siRNA研究CTGF在SSC成纖維細胞膠原Ⅰ、Ⅲ合成中的作用。 方法siRNA轉(zhuǎn)染48小時后，用半定量RT-PCR法和免疫細胞化學法檢測SSC成纖維細胞COLⅠA1、COLⅢA1mRNA的表達和膠原Ⅰ、Ⅲ蛋白含量的變化。 結論SSC成纖維細胞內(nèi)CTGFmRNA的表達