視網(wǎng)膜色素變性大鼠Muller細(xì)胞逆分化為視網(wǎng)膜前體細(xì)胞的研究.pdf

1、視網(wǎng)膜色素變性(Retina pigmentosa)是一種嚴(yán)重的致盲眼病,以光感受器細(xì)胞死亡為主要病理特征,臨床上缺乏有效的治療方法。目前很多研究集中在視網(wǎng)膜干細(xì)胞移植領(lǐng)域,以期望移植的細(xì)胞能夠補(bǔ)充并修復(fù)視網(wǎng)膜色素變性過程中受損的視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞(Tomita et al.,2005)(MacLaren et al.,2006)(West et al.,2008)。雖然視網(wǎng)膜干細(xì)胞移植目前仍存在許多問題,如:移植細(xì)胞存活數(shù)量較少;移植

2、細(xì)胞向光感受器細(xì)胞分化比例較低;難以驗(yàn)證移植細(xì)胞真正參與了宿主視網(wǎng)膜的視覺形成過程等,但是多數(shù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)視網(wǎng)膜干細(xì)胞移植能夠一定程度上改善視網(wǎng)膜色素變性動物模型的視功能(Seiler et al.,2008a)(Wang et al.,2008)Gamin(Gamm et al.)。因此,視網(wǎng)膜干細(xì)胞移植仍被認(rèn)為是治療視網(wǎng)膜色素變性疾病最具有潛在應(yīng)用前景治療方法。
　　 視網(wǎng)膜前體細(xì)胞概念的提出讓人們從另一個(gè)角度認(rèn)識視網(wǎng)膜損傷后自

3、我修復(fù)能力?，F(xiàn)在研究已證實(shí),在成年哺乳動物視網(wǎng)膜內(nèi)多個(gè)部位存在視網(wǎng)膜前體細(xì)胞(Perronand Harris,2000)。如:視網(wǎng)膜睫狀上皮細(xì)胞(Ahmad et al.,2000)(Tropepe et al.,2000)虹膜色素上皮細(xì)胞(Haruta et al.,2001)(Asami et al.,2007)等。最近研究發(fā)現(xiàn),成年動物體內(nèi)的視網(wǎng)膜Miiller細(xì)胞也具有成為視網(wǎng)膜前體細(xì)胞的潛在能力(Fischer and Re

4、h,2001)(Ooto et al.,2004)(Osakada and Takahashi,2007)。本實(shí)驗(yàn)室既往應(yīng)用免疫印跡方法研究發(fā)現(xiàn),視網(wǎng)膜前體細(xì)胞標(biāo)記物Chx10表達(dá)量在RCS(Roval College Surgery,RCS)大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)呈現(xiàn)出生后減低至消失,而成年又出現(xiàn)增加的趨勢。
　　 既往對Müller細(xì)胞的認(rèn)識僅停留在對神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的傳統(tǒng)認(rèn)識上。隨著人們對神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞認(rèn)識的深入,發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜Müller細(xì)

5、胞具有逆分化為視網(wǎng)膜前體細(xì)胞的潛能。在哺乳動物視網(wǎng)膜中Müller細(xì)胞在正常情況無法重新進(jìn)入細(xì)胞周期開始逆分化,但是在一些急性損傷的情況下,如:應(yīng)用NMDA造成小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和無長突細(xì)胞死亡(Karl et al.,2008)應(yīng)用MNU造成大鼠視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞死亡(Wan et al.,2008),或是應(yīng)用激光造成小鼠視網(wǎng)膜急性損傷(Kohno et al.,2006),視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞均可重新進(jìn)入細(xì)胞周期并逆分化為視網(wǎng)膜

6、前體細(xì)胞。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn),外源性給予視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞營養(yǎng)因子,如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain Derived NeurotrophicFactor,BDNF)、膠質(zhì)源性生長因子(Glia Derived Neurotropic Factor,GDNF)可增強(qiáng)其逆分化能力(Nickerson et al.,2008)(Insua et al.,2008)。然而,這些研究都是停留在急性損傷中,尚未見慢性損傷導(dǎo)致Müller細(xì)胞逆分化

7、的報(bào)道。綜合上述各項(xiàng)研究,結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室既往研究結(jié)果,提出假設(shè):RCS大鼠視網(wǎng)膜變性作為一種慢性刺激可導(dǎo)致Müller細(xì)胞出現(xiàn)逆分化并開始表達(dá)視網(wǎng)膜前體細(xì)胞表面標(biāo)志物。視網(wǎng)膜干細(xì)胞移植或聯(lián)合BDNF移植可增強(qiáng)RCS大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞逆分化能力,從而達(dá)到延緩視網(wǎng)膜色素變性的作用。
　　 針對以上假設(shè),本文的主要內(nèi)容及研究結(jié)果如下:
　　 1、應(yīng)用組織化學(xué)方法觀察RCS大鼠發(fā)育過程中視網(wǎng)膜形態(tài)變化,發(fā)現(xiàn)RCS大鼠視網(wǎng)膜

8、形態(tài)改變開始于15天(睜眼時(shí)間),30d時(shí)達(dá)到高峰,90d及120d時(shí)屬于視網(wǎng)膜色素變性晚期;應(yīng)用免疫熒光化學(xué)技術(shù),研究在RCS大鼠視網(wǎng)膜慢性退行性變過程中,視網(wǎng)膜前體細(xì)胞分布特性及變化規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn),RCS大鼠出生后視網(wǎng)膜前體細(xì)胞數(shù)量迅速減少,至睜眼(15d)時(shí)幾乎消失;但在視網(wǎng)膜色素變性高峰期時(shí),視網(wǎng)膜前體細(xì)胞又重新出現(xiàn),并可持續(xù)存在至變性晚期;進(jìn)一步應(yīng)用視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞標(biāo)志物-Vimentin雙重標(biāo)記,發(fā)現(xiàn)在RCS大鼠變性高

9、峰期重新出現(xiàn)的視網(wǎng)膜前體細(xì)胞來源于視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞逆分化。結(jié)果提示,RCS大鼠視網(wǎng)膜色素變性作為慢性刺激,可以導(dǎo)致視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞發(fā)生逆分化。
　　 2、通過條件培養(yǎng)基及傳代培養(yǎng)方法得到的視網(wǎng)膜干細(xì)胞具有自我增殖,自我復(fù)制和多向分化潛能,能夠分化為各類視網(wǎng)膜神經(jīng)元。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測培養(yǎng)3代后的視網(wǎng)膜干細(xì)胞純度較高,可作為本研究中移植的種子細(xì)胞。將DiI紅色熒光標(biāo)記的大鼠視網(wǎng)膜干細(xì)胞經(jīng)鞏膜外路法移植入30天齡的RCS大

10、鼠視網(wǎng)膜下腔。于60d、90d及120d時(shí)檢測移植細(xì)胞存活、遷徙、分化,以及RCS大鼠視功能改善情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),移植細(xì)胞在RCS大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)可以存活至120d,并有向視網(wǎng)膜內(nèi)層遷徙的趨勢;初期移植細(xì)胞存活數(shù)量較多,主要分布在視網(wǎng)膜外核層,后期移植細(xì)胞存活數(shù)量減少,較多分布在視網(wǎng)膜內(nèi)核層。視網(wǎng)膜干細(xì)胞聯(lián)合BDNF移植,有利于移植細(xì)胞在RCS大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)存活。應(yīng)用免疫熒光化學(xué)技術(shù),檢測移植細(xì)胞向各種視網(wǎng)膜神經(jīng)元分化情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜干細(xì)胞

11、移植或聯(lián)合BDNF移植后,移植細(xì)胞在RCS大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)具有向多種視網(wǎng)膜細(xì)胞分化的能力;早期傾向于向光感受器細(xì)胞方向分化,晚期則有較多向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞方向分化;聯(lián)合應(yīng)用BDNF未見明顯促進(jìn)移植細(xì)胞向光感受器細(xì)胞分化。應(yīng)用視網(wǎng)膜電圖(ERG)檢測RCS大鼠視功能改善情況,Rod-ERG b波及Max-ERGb波振幅及潛時(shí)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較發(fā)現(xiàn),視網(wǎng)膜干細(xì)胞移植在術(shù)后1月及2月時(shí)可改善RCS大鼠視功能,具體表現(xiàn)為Rod-b波及Max-b波潛時(shí)的縮短及

12、振幅的增高。聯(lián)合應(yīng)用BDNF后,可在術(shù)后1月時(shí)增強(qiáng)視網(wǎng)膜干細(xì)胞移植對RCS大鼠視功能的改善作用。
　　 3、在視網(wǎng)膜干細(xì)胞移植術(shù)后,應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù),觀察RCS大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞逆分化情況及視網(wǎng)膜前體細(xì)胞分布特點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),視網(wǎng)膜干細(xì)胞移植引起RCS大鼠視網(wǎng)膜前體細(xì)胞數(shù)量增多,且這些增多的視網(wǎng)膜前體細(xì)胞多數(shù)來源于視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞逆分化,即視網(wǎng)膜干細(xì)胞移植增強(qiáng)了RCS大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞逆分化,且部分逆分化

13、的Müller細(xì)胞出現(xiàn)去分化現(xiàn)象,表達(dá)視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞標(biāo)志物-Recoverin:然而,PBS偽手術(shù)及單純注射BDNF不能增強(qiáng)RCS大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞逆分化。經(jīng)過定量計(jì)數(shù)分析比較發(fā)現(xiàn),BDNF聯(lián)合視網(wǎng)膜干細(xì)胞移植有更強(qiáng)的促進(jìn)Müller細(xì)胞逆分化作用。
　　 綜上所述,本課題得出如下結(jié)論:
　　 1、慢性視網(wǎng)膜色素變性這種刺激因素可以引起RCS大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞發(fā)生逆分化,表達(dá)視網(wǎng)膜前體細(xì)胞標(biāo)志物。2、