新城疫病毒V蛋白的表達及其對干擾素活性影響的研究.pdf

1、新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)可以在雞群中引發(fā)以呼吸道、神經系統(tǒng)或是腸道病變?yōu)橹饕Y狀，具有高度傳染性的疾病。由于危害嚴重，其致病和免疫機理一直是研究的熱點。干擾素(IFN)系統(tǒng)是宿主抵抗病毒感染的第一道防線，近年來的研究結果發(fā)現副粘病毒通過RNA編輯作用產生的V蛋白具有阻斷IFN抗病毒活性的功能，因而和病毒的致病性有著密切關系。NDV屬于副粘病毒科禽腮腺炎(Avulavirus)病毒屬，其基因組編碼六

2、種主要結構蛋白，其中P基因可以通過“RNA編輯”的方式編碼產生額外的兩個非結構蛋白-V蛋白和W蛋白。NDV的V蛋白與其他副粘病毒的V蛋白一樣具有相似的特殊結構，可能與NDV毒力有密切關系。 為了深入研究NDVV蛋白的功能及其與病毒致病性的關系，我們通過RT-PCR方法分別獲得雞、鴿和鵝源NDVV蛋白的cDNA，然后分別通過原核表達的重組V蛋白和真核表達載體，在體內外研究了V蛋白對NDV誘生IFN活性的影響，比較了不同宿主V蛋白功

3、能的差異。 本試驗根據NDVP基因序列分別設計合成三條特異性引物，V1和V3用于基因擴增，V2是用來插入G的突變引物。采用RT-PCR方法分別從雞、鴿、鵝源NDV尿囊液中擴增、克隆出NDV部分P基因cDNA，以cDNA為模板，V1和V2為引物PCR擴增V基因的前半段序列并引入了相應的突變。然后以該產物為引物和V3一起通過PCR方法分別獲得雞、鴿和鵝源NDVV基因全長cDNA并將其克隆到pMD18-T載體上，篩選到的雞、鴿、鵝源N

4、DVV基因陽性重組質粒分別命名為pMD18-T-c-V、pMD18-T-p-V和pMD18-T-g-V。對我們獲得的cDNA我們進行了核苷酸序列測定。通過和GenBank中發(fā)表的其它副粘病毒V基因序列同源性比較結果可以發(fā)現：NDVV蛋白的羧基端同樣含有七個半胱氨酸殘基，分別位于第196、200、212、214、217、221和224位，這七個C所形成的結構可以結合兩個Zn2+離子，形成典型的C2H2或C3H4型鋅指基序，這種結構在所有副

5、粘病毒科的成員中存在，可能與病毒的抗干擾素活性和病毒毒力有關。從進化樹上可以看到：利用V蛋白進行NDV遺傳演化分析所得的結果和通過NDVF基因進行分析的結果相一致，提示NDVV基因和其它基因一樣在不斷地的演化當中，并且可能NDV的毒力強弱有一定的相關性。同樣副粘病毒的V蛋白可能是決定副粘病毒分類地位重要依據之一。本研究中雞、鴿、鵝源NDVV基因的核苷酸和氨基酸與LaSota、Clone30、Hert33、QueenslandV4、ZJ1

6、等NDV分離株相應的序列的同源性比較結果發(fā)現：相同宿主來源的毒株無論在核苷酸還是在氨基酸水平上的同源性都很高，這一點在鵝源和鴿源上體現的比較充分，但是雞源在核苷酸和氨基酸上的同源性相對較低，核苷酸多集中在80-85％之間，而氨基酸則多集中在75-80％之間。鴿源和鵝源在V蛋白上均具有特殊的氨基酸殘基，這些氨基酸的點突變能否對影響到所在基因的功能?是否具有宿主特異性?有待進一步的研究來解釋。 由于V蛋白是非結構蛋白且表達量不是很高

7、，很難從病毒感染細胞中提取。也正是這一原因，導致對其功能研究的相對滯后。為了從根本上解決研究V蛋白功能的這一瓶頸問題我們將雞源NDVF48E9的V基因cDNA構建到原核表達載體pET-30c上，構建成F48E9株NDVV蛋白的高效原核表達系統(tǒng)。該表達系統(tǒng)表達重組V蛋白以包涵體的形式存在，分子量大小為28KD左右。我們采用8mol/L脲變性，Ni-NTA柱吸附純化了重組蛋白，經透析復性，得到純化的可溶性NDVV蛋白，純化率達到35％。將復

8、性后的NDVV蛋白免疫21日齡SPF雞(300μg/只)，成功制備出NDVV蛋白的抗血清。在Westernblot檢測發(fā)現F48E9株NDV抗血清可以和重組V蛋白發(fā)生特異性反應，但反應的特異性和靈敏度不如我們制備的重組V蛋白特異性血清。這可能是由于在病毒復制過程中V蛋白的表達水平較高，V蛋白很可能以某種形式與病毒粒子結合而成為免疫原造成的，另外，P蛋白和V蛋白N末端的同源序列所一起的交叉反應也可能是原因之一。 為了在細胞中和雞體

9、內研究V蛋白的功能，我們構建了三種宿主NDVV蛋白的真核表達載體和瞬時表達系統(tǒng)，Westernblot檢測證實三種宿主來源的NDVV蛋白真核表達載體轉染細胞后都能正確表達相應的重組V蛋白，利用該系統(tǒng)我們分別在體內外對V蛋白拮抗IFN活性的作用及其是否存在宿主的特異性進行了初步研究。 應用MTT法體外檢測NDVV重組蛋白拮抗IFN活性發(fā)現：1.在接種NDV后，表達V蛋白的細胞中IFN活性水平低于沒有表達V蛋白的細胞。說明NDVV蛋

10、白對IFN的具有一定的拮抗作用。2.所有表達NDVV蛋白的細胞在接種LaSota或F48E9后，前者所誘導產生的IFN水平明顯高于后者的，說明不同毒力的NDV分離株接種細胞后產生IFN活性的拮抗作用的效果是不同的。3.表達雞源的重組V蛋白的細胞中，由NDVLaSota或F48E9誘導產生的IFN水平與表達鴿源或鵝源NDVV蛋白的細胞中產生的IFN水平之間存在顯著差異，然而表達鴿源和鵝源NDVV蛋白的細胞所產生的IFN活性則沒有顯著差異。

11、可能是由于鴿源和鵝源分離株在V蛋白上的點突變和C端的CTDs區(qū)域與雞源的同源性高低有關。盡管鵝源和鴿源分離株之間在整個V蛋白氨基酸水平上存在一定差異，但它們整體的同源性很高，可達80.4％，尤其是V蛋白C末端181位以后的氨基酸同源性更高達96.6％，因此它們的V蛋白所發(fā)揮的效應可能相差不多，刺激細胞產生IFN活性也就很接近了。這一個結果表明NDVV蛋白拮抗IFN活性的能力可能存在著宿主差異。 在動物實驗中，我們將純化的F48E

12、9株NDVV蛋白、pCI-neo-c-V和LaSota活苗進行不同組合分別免疫21日齡SPF雞(300μg/只)，二免21天后接種NDVF48E9強毒，攻毒后采集血液樣本，檢測血清中的IFN活性，觀察雞的死亡率。結果表明，F48E9株NDVV蛋白和pCI-neo-c-V聯合免疫實驗組機體血清中的IFN活性最低，單獨免疫提純的pCI-neo-c-V質粒實驗組機體血清中的IFN與對照組相近。各免疫組實驗動物血清中IFN水平的變化趨勢是高到低

13、依次為L＞L+P＞(L+Pr)+(L+P)＞(L+P)+(L+Pr)＞L+Pr＞L+P+Pr。在免疫物不同的情況下，導致血清中IFN活性降低的程度是不一樣的。純化的V蛋白在免疫反應中起到了主導性的作用，質粒在免疫反應中的作用不是很大，但仍以質粒和蛋白聯合免疫的實驗組IFN活性最低，與兩次免疫物都為L+Pr的實驗組還是有一定程度的區(qū)別?？偟膩碚f，純化的V蛋白在影響免疫反應上起著主導性的作用，說明機體內是由V蛋白來拮抗IFN介導的抗病毒體系

14、的，這與體外檢測的結果是一致的。各實驗組的死亡率分析發(fā)現，P+Pr實驗組最先出現死亡，其次是免疫Pr的實驗組，緊跟著的是單純免疫質粒P和水對照實驗組，而LaSota單獨免疫組沒有發(fā)病和死亡。這一結果進一步證實了NDVV蛋白在雞體內發(fā)揮了IFN拮抗物的作用，破壞了動物體內由IFN介導的適應性免疫應答。 綜上所述，NDVV蛋白具有拮抗IFN活性的作用，并且這種作用已足以影響疫苗免疫對強毒株攻擊的保護水平，說明V蛋白和NDV毒力有一定