Frat1在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其與β-catenin、TCF-4相關(guān)性的研究.pdf

1、目的：
　　 研究證明:Frat(frequently rearranged in advanced T-cell lymphomas)是Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑的正向調(diào)節(jié)因子,通過與糖原合成酶激酶3(GSK3)結(jié)合,抑制GSK3依賴的磷酸化作用,從而使β-catenin水平升高,β-catenin通過與TCF4結(jié)合而激活靶基因。目前,已有研究報(bào)道FRAT1在一些惡性腫瘤中有過表達(dá),但是其過表達(dá)是否與腫瘤的臨床病理因素有關(guān)尚不清楚,在

2、腫瘤組織中Frat1過表達(dá)與β-catenin表達(dá)的關(guān)系是否與細(xì)胞系當(dāng)中所獲得的結(jié)果一致也未見報(bào)道。因此我們選擇了137例肺癌手術(shù)患者的標(biāo)本(其中78例有隨訪資料,59例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶標(biāo)本)對(duì)Frat1的表達(dá)與β-catenin、TCF4表達(dá)的關(guān)系進(jìn)行探討,以明確在肺癌組織中的表達(dá)情況和與臨床病理因素之間可能的關(guān)系。
　　 材料與方法：
　　 1、材料
　　 137例原發(fā)性肺癌患者的術(shù)后組織標(biāo)本收集自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)

3、附屬第一醫(yī)院病理科1998-2005年存檔蠟塊。男性89例,女性48例,男女性別比1.8:1。年齡33～76歲(中位年齡58歲)。按UICC(2002)腫瘤TNM分期標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ期34例,Ⅱ期37例,Ⅲ期61例,Ⅳ期5例。按WHO(2004)肺癌分類標(biāo)準(zhǔn),鱗狀細(xì)胞癌63例,腺癌74例。高分化30例,中分化74例,低分化33例。對(duì)其中59例肺癌患者的原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶組織標(biāo)本對(duì)比分析。對(duì)其中78例進(jìn)行了術(shù)后隨訪,隨訪日期計(jì)算從手術(shù)日起,到因

4、復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移而死亡或隨訪截止日期為止,截止日期為2007年8月25日。所有病例術(shù)前均未接受放、化療。
　　 2、免疫組織化學(xué)染色
　　 組織經(jīng)中性福爾馬林固定、石蠟包埋,制成4um連續(xù)切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后行LSAB法免疫組化染色。一抗為羊抗鼠Frat1多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA1:50)、鼠抗人β-catenin單克隆抗體(即用型,購自

5、福州邁新生物技術(shù)公司)和鼠抗人TCF4多克隆抗體(SantaCruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA1:100)。生物素標(biāo)記的二抗(MB-9207,Maixin Biotechnology,Fuzhou,China)為即用型。3,3’-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)進(jìn)行顯色。以磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer Saline,PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照。SP超敏免疫組織化學(xué)試劑盒和DAB酶底物顯色試

6、劑盒購自福州邁新生物技術(shù)公司。
　　 3、結(jié)果判定
　　 選腫瘤細(xì)胞陽性染色集中區(qū)域,每張切片計(jì)數(shù)400個(gè)癌細(xì)胞,由兩名病理醫(yī)師雙盲觀測(cè)。Frat1評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):在正常的肺泡上皮及支氣管上皮為陰性表達(dá),陽性細(xì)胞≤10％為陰性表達(dá);≥11％為陽性表達(dá)。β-catenin評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考Xu等標(biāo)準(zhǔn).正常上皮組織中陽性表達(dá)并定位于細(xì)胞膜,陽性細(xì)胞數(shù)＞90％。陽性瘤細(xì)胞數(shù)≤90％為表達(dá)降低,10％以上瘤細(xì)胞核/漿表達(dá)為異位表達(dá),異位表達(dá)

7、和表達(dá)降低統(tǒng)歸為異常表達(dá)。TCF4判定標(biāo)準(zhǔn)與Frat1評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)相同。
　　 4、細(xì)胞培養(yǎng)
　　 人類肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、LTE、661、460、BE1培養(yǎng)于含10％滅活胎牛血清、2.3g/LNaHCO3、100units/ml青鏈霉素的RPMI1640(Invitrogen,美國(guó))培養(yǎng)液中,貼壁生長(zhǎng),每2天用0.25％胰酶(Invitrogen)消化傳代。
　　 5、Transwell
　　 用無血清的R

8、PMI1640培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)整至5×106個(gè)/ml,取100μL細(xì)胞懸液滴入上室內(nèi)(5×105個(gè)細(xì)胞),下室加入含有10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,上下室之間用孔徑為8μm的聚碳酸酯微孔濾膜(Corning,美國(guó))分開,將小室置37℃,5％CO2條件下分別放置6,12,18h后,棄去上室內(nèi)液體,擦盡膜上Matrigel膠,100％甲醇固定30分鐘,常規(guī)蘇木素染色,光鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)。
　　 6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　

9、 應(yīng)用SPSS for Windows14.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。免疫組化結(jié)果采用x2檢驗(yàn),Spearman等級(jí)相關(guān)分析,Kaplan-Meier法,Log-Rank檢驗(yàn)。細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用t檢驗(yàn),P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、Frat1在肺癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理因素的關(guān)系
　　 Frat1在正常的肺泡上皮及支氣管上皮為陰性表達(dá)。Frat1在肺癌組織中的陽性信號(hào)主要表達(dá)在細(xì)胞漿

10、,為彌漫分布,偶見胞核/胞漿陽性。陽性表達(dá)率為62.0％(85/137)。中分化(25/36,73.5％)、低分化(23/27,85.2％)肺癌中Frat1的表達(dá)高于高分化(4/17,23.5％)的病例(P=0.035)。
　　 有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例Frat1異常過表達(dá)率為68.0％(66/97)高于沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例的47.5％(19/40)的病例(p=0.024)。Ⅰ期、Ⅱ期患者的陽性率為50.7％(35/69)明顯低于Ⅲ期、

11、Ⅳ期患者的陽性率73.5％(50/68)(P=0.006)。
　　 在配對(duì)資料中,Frat1在轉(zhuǎn)移灶中的異常過表達(dá)率為83％(49/59)明顯高于原發(fā)灶的異常表達(dá)率64.4％(38/59)(P=0.015)。
　　 在78例有隨訪資料的術(shù)后患者當(dāng)中,生存時(shí)間為3-112個(gè)月,平均生存時(shí)間為46.90±3.70個(gè)月,中位生存時(shí)間為37.72±5.24個(gè)月。我們用Kaplan-Meier法(Log Rarlk檢驗(yàn))對(duì)78例N

12、SCLC患者術(shù)后生存期進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示,Frat1陽性表達(dá)患者術(shù)后生存時(shí)間明顯小于正常表達(dá)者(p=0.037)。
　　 2、Frat1過表達(dá)與β-Catenin和TCF4的異常表達(dá)正相關(guān)
　　 β-Catenin在正常的支氣管上皮為膜陽性表達(dá),在肺癌組織中表現(xiàn)為膜表達(dá)減弱、胞漿或胞核中出現(xiàn)異常表達(dá)。β-Catenin的異常表達(dá)率為68.6％(94/137)。中、低分化肺癌中β-Catenin的異常表達(dá)高于高分化的病例

13、(分別為高分化43.3％、中分化73.0％、低分化81.8％,P=0.002)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例β-Catenin異常表達(dá)(72/97)高于沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(22/40)的病例(p=0.027)。在配對(duì)資料中β-Catenin在轉(zhuǎn)移灶中的異常表達(dá)(53/59)高于原發(fā)灶的異常表達(dá)(43/59)(P=0.041)。β-Catenin在Ⅲ期、Ⅳ期患者的表達(dá)(53/68)高于Ⅰ期、Ⅱ期患者的表達(dá)(41/69)(P=0.020)。用Kaplan

14、-Meier法(Log Rank檢驗(yàn))對(duì)78例NSCLC患者術(shù)后生存期進(jìn)行了分析。β-Catenin表達(dá)異常的患者的生存時(shí)間明顯小于正常表達(dá)的患者(P=0.012)。
　　 TCF4在正常的支氣管上皮為陰性表達(dá),在肺癌組織中陽性信號(hào)主要表達(dá)在細(xì)胞漿,為彌漫分布,偶見胞核/胞漿陽性。TCF4的異常表達(dá)率為70.1％。中、低分化肺癌中TCF4的表達(dá)高于高分化的病例(分別為高分化33.3％、中分化77.0％、低分化75.8％,P=0.

15、007)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例TCF4異常表達(dá)(73/97)高于沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(23/40)的病例(p=0.039)。在配對(duì)資料中TCF4在轉(zhuǎn)移灶中的異常表達(dá)(54/59)高于原發(fā)灶的異常表達(dá)(43/59)(P=0.019)。TCF4在Ⅲ期、Ⅳ期患者的表達(dá)(55/68)高于Ⅰ期、Ⅱ期患者的表達(dá)(41/69)(P=0.006)。用Kaplan-Meier法(Log Rank檢驗(yàn))對(duì)78例NSCLC患者術(shù)后生存期進(jìn)行了分析。TCF4表達(dá)異常的

16、患者的生存時(shí)間明顯小于正常表達(dá)的患者(P=0.033)。
　　 在137例肺癌原發(fā)灶中Frat1過表達(dá)與β-catenin的異常表達(dá)呈正相關(guān)(p=0.003)TCF4的異常表達(dá)與Frat1的過表達(dá)同時(shí)呈正相關(guān)(p=0.037)。
　　 3外源性的Frat1抗體可以降低Frat1高表達(dá)的肺癌細(xì)胞系中β-Catenin和TCF4的表達(dá)水平,下調(diào)其侵襲能力。
　　 結(jié)論：
　　 1、Frat1在肺癌組織中呈高表