HIV-1病毒Tat蛋白影響細(xì)胞輻射敏感性及作用機(jī)制研究.pdf

1、HIV感染導(dǎo)致人類(lèi)免疫缺陷綜合癥(AIDS)有可能引起更多腫瘤的發(fā)生，研究表明卡波氏肉瘤(KS)和非何杰金淋巴瘤的發(fā)病率在艾滋病人要比普通人群高出20倍。腺癌、何杰金氏淋巴瘤和平滑肌肉瘤在兒童發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)較普通人群高出5—20倍。對(duì)于HIV感染的腫瘤病人，手術(shù)治療有高風(fēng)險(xiǎn)性，放射治療是主要的治療方式。近年來(lái)臨床研究發(fā)現(xiàn)，艾滋病合并腫瘤患者放療后產(chǎn)生的正常組織和皮膚毒性反應(yīng)明顯高于普通腫瘤患者。實(shí)驗(yàn)室研究也進(jìn)一步支持臨床觀察，AIDS合并非

2、何杰金淋巴瘤的病人對(duì)輻射反應(yīng)敏感，來(lái)源于HIV感染的卡波氏肉瘤病人皮膚活組織的成纖維細(xì)胞，對(duì)輻射較非HIV感染的細(xì)胞敏感。人類(lèi)免疫缺陷病病毒(HIV)表達(dá)的Tat蛋白是HIV感染早期所合成的小分子調(diào)節(jié)蛋白，能促進(jìn)HIV基因表達(dá)，增加HIV病毒的復(fù)制和感染性。此外，在HIV感染過(guò)程中，Tat蛋白能分泌到細(xì)胞外，作用于未受HIV感染的CD4+細(xì)胞和單核．巨噬細(xì)胞，使其更易受HIV的感染。因此Tat作為一個(gè)胞外蛋白和細(xì)胞基因表達(dá)的激活因子在A

3、IDS發(fā)生及相關(guān)病變過(guò)程中起重要作用。目前研究顯示，Tat蛋白與機(jī)體交互作用會(huì)影響細(xì)胞輻射敏感性，但對(duì)于AIDS合并腫瘤的病人輻射敏感性發(fā)生改變的機(jī)制仍不清楚。 本研究使用轉(zhuǎn)染HIV-1tat基因的人橫紋肌肉瘤細(xì)胞系模型，探討Tat蛋白對(duì)細(xì)胞輻射敏感性的影響以及相關(guān)機(jī)制，獲得如下主要結(jié)果： (1)使用重疊PCR技術(shù)，從我國(guó)河南省駐馬店地區(qū)的一名HIV-1感染者外周血標(biāo)本中擴(kuò)增出完整的tat基因序列。將該基因編碼產(chǎn)物與其它

4、HIV-1病毒株Tat蛋白進(jìn)行多序列對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)：第一外顯子編碼產(chǎn)物的三個(gè)保守區(qū)域的氨基酸組成大致是相同的，只有少數(shù)氨基酸存在差異，tat基因的克隆為研究其功能并以其為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)和篩選抗艾滋病的藥物奠定基礎(chǔ)。 (2)成功構(gòu)建了表達(dá)Tat蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞模型，使用報(bào)告質(zhì)粒KB／SPlLTR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，90％以上的TE671．tat細(xì)胞具有Tat蛋白的轉(zhuǎn)錄激活功能，為進(jìn)一步研究Tat蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。 (3)利用兩個(gè)表達(dá)Tat

5、蛋白的細(xì)胞系TT2和TE671-Tat進(jìn)行對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)：Tat蛋白能促進(jìn)細(xì)胞增殖，表達(dá)Tat蛋白的細(xì)胞其增殖速度加快；細(xì)胞活存分析證明，表達(dá)Tat蛋白的細(xì)胞對(duì)電離輻射敏感性明顯增加；單細(xì)胞中性電泳以及7-H2AX位點(diǎn)的檢測(cè)證明，Tat蛋白能夠降低細(xì)胞對(duì)輻射誘發(fā)DNA雙鏈斷裂修復(fù)能力。另外，在接受電離輻射后，表達(dá)Tat蛋白的細(xì)胞凋亡增加。 (4)細(xì)胞周期檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TE671細(xì)胞和TT2細(xì)胞經(jīng)4GyY射線照射后表現(xiàn)出程度不同的G2／

6、M期阻滯，有意思的是表達(dá)Tat的TT2細(xì)胞G2／M阻滯出現(xiàn)較TE671細(xì)胞晚，而在照射后48h時(shí)TE671細(xì)胞G2／M期阻滯己恢復(fù)，但TT2細(xì)胞阻滯仍很顯著。另外，TT2細(xì)胞S期阻滯時(shí)間延長(zhǎng)。表明Tat蛋白能導(dǎo)致細(xì)胞周期G2／M期檢查點(diǎn)功能紊亂，致使電離輻射作用后的細(xì)胞周期反應(yīng)異常。 (5)在基因芯片的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，與DNA損傷修復(fù)及細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的5個(gè)基因Cdc25C、KIF2C、Cdc20、DNA-PKcs和CTSl在轉(zhuǎn)染t

7、砒基因的細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)；首次發(fā)現(xiàn)，HIV-1Tat蛋白增加細(xì)胞對(duì)電離輻射的敏感性，至少有部分原因是通過(guò)抑制DNA-PKcs表達(dá)降低DNA雙鏈斷裂的修復(fù)能力實(shí)現(xiàn)。 (6)首次發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期蛋白cyclinBl的表達(dá)在轉(zhuǎn)染tat基因細(xì)胞中明顯增強(qiáng)，但對(duì)cyclinB1mRNA水平無(wú)明顯影響。放線菌酮阻斷及免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明：cyclinBl表達(dá)水平的增強(qiáng)是蛋白穩(wěn)定性改變的結(jié)果。另外，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步揭示：表達(dá)Tat蛋白細(xì)胞中Cdkl酪氨酸