人源Naive Fab抗體庫的構建和抗Met抗體片斷的篩選及特征鑒定.pdf

1、南京醫(yī)科大學博士學位論文人源NaiveFab抗體庫的構建和抗Met抗體片斷的篩選及特征鑒定姓名：焦永軍申請學位級別：博士專業(yè)：病原生物學指導教師：管曉虹曹伯良20050417南京醫(yī)科大學博士學住論文我們設計并構建了庫容為2。0109的大容量人源NaiveFab抗體庫，并應用生物篩選法從中成功地篩選出一株抗Met人源抗體分子，該分子被命名為hFabMet一1。hFabMeti的生物學特性及功能已被詳細鑒定，具體內容概括如下。買驗一人源Na

2、iveFab抗體庫的構建1Fab基因的克隆收集15人份臨床檢驗后剩余的成人骨髓，分離淋巴細胞，抽提純化總RNA，反轉錄成cDNA。3輪PCR擴增出編碼抗體Fab片斷的基因庫。以cDNA為模板擴增抗體重鏈、輕鏈可變區(qū)基因；重鏈C眥、輕鏈恒定區(qū)cL基因分別來自pComb3XTT和pComb3X％兩個重組載體；以Overlap—PCR分別連接重輕鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)基因；最后再以Overlap—PCR連接重鏈Fd段基因和輕鏈全長基因而獲得Fab

3、基因。2人源NaiveFab抗體庫的構建Fab基因和pComb3xsS載體分別經SfiI酶切后，進行二者連接。重組質粒用電轉化法導入感受態(tài)大腸桿菌一XLlblue進行抗體庫構建。通過優(yōu)化可影響轉化效率的參數(shù)，如轉化溫度，電擊條件的設置，電擊后樣品的處理及DNA樣品的準備等，使得每一次轉化可獲得20107個轉化子。經過約100次電轉化，我們獲得了庫容為20109全人源Naive抗體庫。DNA鋇q序結果表明大于86％(I3／I5)的克隆含有

4、插入方向正確的全長Fab基因序列。實驗二人源NaiveFab抗體庫的篩選及抗MetFab抗體片斷的特征鑒定1抗MetFab抗體片斷的篩選為了使所篩出的抗Met抗體具有腫瘤治療的潛能，我們以表達于活體細胞s114表面的Met分子為靶標進行篩庫。抗體庫首先與S114的前體細胞NIH3T3(Met一)作用以去除一些非相關抗體的富集，然后再以s114細胞(Met)為靶細胞進行篩庫。這種篩庫方式的目的有二：期望使得篩出的抗體能在體內與具有特定空間

5、構像的Met分子結合；提高了Met特異性抗體的富集效率。經過7輪篩選，隨機調取504“克隆以PhageELISA進行鑒定，17個為陽性。其中10個克隆的DNAj91q序結果表明它們?yōu)閱我豢寺。麨閔FabMet1。2hFab—Met一1的特征鑒定及功能分析hFab—Met一1經表達、純化后，其特異性通過ELIsA，免疫沉淀，免疫轉印和流式細胞術等實驗進行鑒定。結果表明，hFabMet1能夠與具有特定空間構像的Met分子胞外結構域特異性