抗SARS病毒人源Fab抗體的制備研究.pdf

1、SARS冠狀病毒引起的嚴重呼吸系統(tǒng)綜合癥，具有很高的傳染性和致死率，目前尚無特異性預防及治療藥物，研究抗SARS病毒人源抗體被動免疫，將有助于對SARS病人的救治。 目前噬菌體抗體庫技術已成為人源抗體制備的強有力工具，它易于操作，篩選容量大，有利于獲得一些稀有抗體，并可直接獲得完全人源的單克隆抗體。本研究工作可分為4個部分：抗體庫的構建、抗體庫的富集及特異性單克隆抗體的篩選、中和抗體M1A的可溶性表達及純化、M1A抗體活性的定量

2、分析。 一、噬菌體抗體庫的構建 建立人抗SARS病毒Fab抗體基因庫的淋巴細胞來源于恢復期SARS患者的外周血，免疫熒光及體外中和試驗檢測抗SARS病毒抗體的滴度≥1：256及1：64，這為建立可能篩選出高親和力的抗體基因庫創(chuàng)造了條件。提取淋巴細胞RNA，利用RT-PCR方法克隆出7條重鏈Fd段抗體基因和9條輕鏈抗體基因，依次將輕鏈基因混合物和重鏈基因混合物酶切后連入載體pComb3內(nèi)，構建成人源Fab分子噬菌體表面呈現(xiàn)

3、文庫，庫容約2×106。 二、抗體庫的富集及特異性單克隆抗體的篩選 目前大量研究結(jié)果表明，SARS病毒的4個主要結(jié)構蛋白中，S蛋白的主要功能是通過特異受體介導病毒與靶細胞結(jié)合，引起細胞融合，它是宿主免疫應答的重要靶位。從抗體庫中篩選抗SARS病毒中和抗體，以S蛋白作為篩選靶標，對抗體庫進行了富集篩選，經(jīng)過4輪的“吸附結(jié)合-洗脫-擴增”過程，富集了抗S蛋白噬菌體抗體庫。 人源單克隆抗體的篩選分為兩個過程，結(jié)合特異性

4、和中和活性的篩選。首先確立了可靠的雙抗體夾心ELISA方法檢測抗S蛋白特異性抗體。從50株隨機挑取的Fab抗體克隆中篩選出12株抗S蛋白特異性抗體，然后測定其對SARS病毒的中和活性，篩選到一株抗體，有明顯的抗SARS病毒中和活性，可推遲細胞病變的發(fā)生，編號為M1A；基因測序分析表明M1A抗體的輕鏈為VK3a家族基因，重鏈為VH3家族基因。 三、M1A抗體的可溶性表達及純化 將M1A基因克隆入載體PET32a，首先通過誘

5、導前不同菌體濃度及不同誘導溫度條件下蛋白表達量的差異檢測，確定合適的誘導表達條件，進行表達。然后用親和層析法對上清和菌體中的蛋白進行提取，從200m;菌液中得到了10mg的抗體蛋白，非變性聚丙烯酰胺電泳顯示產(chǎn)物為單一條純化帶，表明表達純化后獲得了高純度的M1A抗體。 四、M1A抗體結(jié)合活性及中和活性的定量分析 經(jīng)雙抗體夾心ELISA及免疫熒光法檢測證實M1A抗體可特異性結(jié)合S蛋白。在用100TCID50的SARS病毒，0

6、.25mg/ml抗體濃度下進行中和試驗，可使細胞病變時間推遲2d；而在0.5mg/ml濃度下，可完全中和100TCID50的SARS病毒，連續(xù)7d實驗組細胞無病變發(fā)生。用實時定量PCR對0.5mg/mlM1A作用的實驗組和病毒對照組中每日病毒量的差異進行了檢測，結(jié)果表明實驗組中的病毒量顯著低于對照組，用分子生物學方法確定了M1A抗體的抗SARS病毒中和活性。 在此基礎上，對M1A抗體的結(jié)合位點進行初步研究。2C5為具有中和抗體活

7、性的鼠源抗SARS病毒單抗，針對的抗原結(jié)合位點在SARS病毒S1蛋白上350～535氨基酸序列之間(SARS病毒與宿主細胞表面受體的結(jié)合位點)。競爭ELISA結(jié)果表明M1A可部分抑制2C5與S蛋白的結(jié)合，但不能完全抑制，說明M1A抗體的結(jié)合表位可能與SARS病毒及宿主細胞表面結(jié)合位點相關。 人源抗SARS病毒中和抗體的研究目前國內(nèi)還未有報道，本研究利用噬菌體表面展示技術，成功地制備了抗SARS病毒中和抗體，對于探索SARS感染的