抗巨細胞病毒人源化抗體的研究.pdf

1、目的:意義人類巨細胞病毒(humancytomegalovirus，HCMV)是Smith等在1956年首先從一名死亡嬰兒的頜下腺中分離出來的一種病毒，1964年正式命名為巨細胞病毒。它屬β亞科皰疹病毒，為雙鏈DNA病毒，直徑約180～250nm，是一種廣泛傳播的種屬特異性病毒。人類感染該病毒后多呈亞臨床感染或潛伏感染。在多數(shù)免疫功能正常個體中一般不產生明顯的臨床表現(xiàn)，然而卻能持續(xù)排放病毒，造成廣泛傳播。但是，巨細胞病毒對免疫低下患者、

2、育齡婦女及兒童危害極大。在免疫功能低下人群中，潛伏感染的病毒常會被激活，導致嚴重的甚至是致命性的后果。因此，關于巨細胞病毒的預防和治療研究日益受到重視。 HCMV也同其它病毒一樣，通過吸附、侵入細胞、復制及釋放這一循環(huán)方式在人體內存活，能逃逸免疫識別并持續(xù)感染。病毒吸附到宿主細胞上是病毒感染和擴散的起點，阻斷病毒的吸附對于防止病毒感染具有至關重要的意義。HCMV糖蛋白B(gB，glycoproteinB)為HCMV包膜中最豐富的

3、糖蛋白，占包膜蛋白的50％以上。gB是由跨膜蛋白gp55(glycoprotein55)和表面蛋白gp116(glycoprotein116)組成的Ⅰ型膜糖蛋白。gp55位于羧基端，攜帶占免疫優(yōu)勢的抗原決定簇，gp116位于氨基端，亦攜帶抗原決定簇，蛋白復合物總長為906個氨基酸。gB的主要致病機制在于提高病毒體穿透力，促進細胞間感染的擴散。研究表明，HCMVgB的中和抗體能阻斷病毒感染。吸附抑制和感染力中和實驗表明這些抗體能阻止病毒體

4、向細胞穿透。電鏡分析顯示，抗體能阻斷感染的擴散，抗體中和的HCMV病毒體滯留在細胞表面，細胞內的病毒顆粒減少。因此gB是一個非常重要的HCMV治療靶標。目前HCMVgB抗原性的研究已較為清楚，已發(fā)現(xiàn)的三個線性抗體結合位點中，其中兩個是病毒中和抗體的靶位。AD1是gB中首要的抗體結合位點，該抗原決定簇由位于552-635氨基酸間的84個氨基酸組成。HCMV感染的病人血清中gB特異性抗體反應中50％以上直接針對AD1。gB的第二重要的抗體結

5、合位點為AD2，該抗原決定簇由位于50-86氨基酸間的37個氨基酸組成。HCMV感染的病人血清中gB特異性抗體反應中30％以上針對AD2(2,3,4)。 目前在臨床上治療CMV的常用藥物，如ganciclovir、valganciclovir、cidofovir等是核苷酸的衍生物或類似物，雖然對病毒的復制和增殖具有較好的阻止作用，但是這些藥物在阻止病毒復制與增殖的同時，對宿主細胞的轉錄和復制過程造成嚴重影響，具有較強的毒副作用。

6、鑒于上述抗病毒藥物的缺陷，人們開始關注采用免疫方法對CMV進行防治。隨著基因工程技術的發(fā)展，特異性抗病毒人源化抗體已經成為病毒性疾病預防和治療最有前景的生物制品之一。 本研究分別以位于AD1和AD2的表位肽P1和P2為靶標，收集HCMV病毒抗體陽性患者的外周血淋巴細胞，提取RNA，設計合成引物，通過RT-PCR分別獲得抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)，將重鏈和輕鏈連接后，構建噬菌體抗體庫；將抗體庫用于篩選抗P1和P2表位肽的抗體，經過多次的

7、構庫和篩選后，隨后對陽性克隆進行了初步鑒定，獲得了4株抗體不僅能與表位肽P1結合，而且能與gB完整蛋白結合，具有良好的特異性。為后續(xù)開發(fā)具有自主知識產權的生物工程藥物打下良好的基礎。 材料和方法:主要試劑和儀器設備(略)主要方法1.收集HCMV抗體陽性患者外周血淋巴細胞，通過ELISA檢測試劑盒鑒定HCMVIgG陽性標本。 2.采用不連續(xù)梯度法分離外周血淋巴細胞；用Trizol法提取淋巴細胞的RNA，變性凝膠電泳檢測RN

8、A的完整性；通過逆轉錄反應獲取cDNA，以β-actin為內參進行PCR，判斷逆轉錄反應是否成功；取逆轉錄成功的樣品進行PCR，分別擴增抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的編碼序列，純化后通過overlapPCR將抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)編碼片段裝配成ScFv片段，將裝配后的片段以及載體pComb3X分別用限制性內切酶SfiⅠ酶切，經凝膠電泳分離純化后連接，電轉化構建人源化抗體庫。 3.從GenBank搜索目前已知的5種人巨細胞病毒外膜糖蛋白gB

9、蛋白序列，應用cluster程序進行序列比對，確定gB蛋白的保守區(qū)域。在此基礎上，分析外膜糖蛋白gB的親疏水性、可及性、抗原性以及二級結構等參數(shù)，綜合生物信息學和文獻分析，設計并合成表位肽。 4.對抗體庫進行篩選，并對獲得的陽性克隆用ELISA、dot-blot和western-blot進行初步鑒定。并將鑒定后的抗體序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫。 主要結果1.臨床患者外周血標本的收集和檢查2.共收集臨床患者外周血標本21

10、6例，其中HCMVIgG陽性標本159份，HCMV抗體陽性率72.2％，與以往資料所顯示的數(shù)據(jù)大致相當。 3.外周血淋巴細胞RNA的提取、引物的設計和抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)編碼序列的擴增 4.共提取外周血淋巴細胞RNA159份，RNA電泳結果顯示完整性良好；內參β-actin擴增后顯示逆轉錄反應成功；抗體重鏈可變區(qū)編碼序列的RT-PCR擴增產物長度約為400bp，抗體kappa、lamda輕鏈可變區(qū)編碼序列RT-PCR結果

11、在350bp左右；成功獲得55種RT-PCR擴增組合。 5.重鏈輕鏈可變區(qū)編碼序列的裝配以及抗體庫的構建6.ScFv片段在750-800bp之間；經12批共66次電轉化后構建的抗體庫總容量約為4.5*108，為后續(xù)篩選抗巨細胞病毒人源化抗體奠定了基礎。 7.巨細胞病毒外膜糖蛋白gB表位肽的選擇8.設計和合成表位肽P1TEECQLPSLKIFIAG(607-621位于AD1)和P2NETIYNTTLKYGDVV(70-84

12、位于AD2功能域)，作為靶標篩選抗體庫。 9.抗體庫的篩選和陽性結果的初步鑒定10.獲得針對P1的噬菌體抗體44株，P2的篩選沒有陽性結果；測序獲得5株P1的噬菌體抗體序列，分別為P1-24、P1-25、P1-26、P1-28、P1-29；鑒定出能同時與表位肽P1和gB完整蛋白結合的噬菌體抗體4株，分別為P1-24、P1-25、P1-26、P1-28。依次將鑒定后的序列遞交GenBank數(shù)據(jù)庫，序列編號分別為DQ001147、D