大鼠遠端結腸平滑肌鈣庫操縱性通道及其功能的研究.pdf

1、在平滑肌收縮過程中，胞內Ca2+濃度的變化是平滑肌細胞收縮的誘導因素，細胞外Ca2+內流是引起胞內Ca2+濃度升高的主要來源。一般認為，電壓操縱性Ca2+通道(voltage-operatedCa2+channel，VOCC)是介導平滑肌收縮過程中胞外Ca2+內流的主要機制，但近期發(fā)現鈣庫操縱性(store-operated)和受體操縱性(receptor-operated)通道也參與平滑肌細胞的收縮反應。 當細胞外的信號激活受

2、體后，通過興奮性G蛋白激活磷脂酶C(phospholipaseC，PLC)，后者水解磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidylinositolbiphosphate，PIP2)，生成1，4，5-三磷酸肌醇(1,4,5-triphosphateinositol，IP3)和二酰甘油(diacylglycerol，DG)。IP3作用于內質網(endoplasmicreticulum，ER)或肌漿網(sacroplasmicreticulum，

3、SR)，引起鈣庫釋放Ca2+。當鈣庫耗竭，誘發(fā)細胞膜上某種Ca2+通道的開放而促進胞外Ca2+內流，使鈣庫重新充盈，這種Ca2+通道被定義為鈣庫操縱性通道(store-operatedCa2+channel，SOCC)，該通道介導的Ca2+內流稱為庫容性Ca2+內流(capacitativecalciumentry，CCE)。既往的研究發(fā)現VOCC是介導豚鼠遠端結腸平滑肌收縮的主要機制，但對于SOCC是否存在于遠端結腸平滑肌細胞上，以及

4、其生理功能為何尚不清楚，本研究在以往對結腸動力研究的基礎上，應用細胞內Ca2+濃度測定和生物換能技術，從細胞和組織器官水平觀察大鼠遠端結腸平滑肌細胞上SOCC，分析CCE在影響或控制遠端結腸平滑肌動力信號轉導中的作用，并對CCE是否參與乙酰膽堿(ACh)誘導的遠端結腸平滑肌收縮作了初步探討。 1大鼠遠端結腸平滑肌細胞上的SOCC 用[Ca2+]i變化為指標，研究了毒胡蘿卜素(TG)和咖啡因(CAF)對酶解分離的大鼠遠端結

5、腸平滑肌細胞[Ca2+]i的影響。在無Ca2+緩沖液中，TG(1μmol·L-1)以及CAF(10mmol·L-1)分別使[Ca2+]i由靜息時68.32±3.43nmol·L-1升高到240.85±12.65nmol·L-1、481.25±34.77nmol·L-1。繼之，向細胞外液中引入兩種濃度的Ca2+(1.5mmol·L-1和3.0mmol·L-1)，可引起[Ca2+]i進一步升高，分別為457.55±19.80nmol·L-1

6、、1005.93±54.62nmol·L-1；643.88±34.65nmol·L-1、920.16±43.25nmol·L-1。且上述升高效應對維拉帕米(Ver)(5μmol·L-1)以及高濃度KCl(40mmol·L-1)引起的細胞膜去極化不敏感，但可被La3+(1mmol·L-1)抑制。上述結果提示，在酶解分離的大鼠遠端結腸平滑肌細胞上，存在因胞內鈣庫耗竭所激活的SOCC，為支持在電興奮性細胞上存在庫容性Ca2+內流提供了實驗依據

7、。 2CCE參與大鼠遠端結腸平滑肌動力變化的信號轉導 利用離體器官灌流、并通過張力換能器、數據采集分析系統測定遠端結腸縱形肌的張力，觀察了CCE在大鼠遠端結腸平滑肌動力變化的信號轉導中的作用。結果發(fā)現，TG(10nmol·L-1～1μmol·L-1)誘導結腸縱形肌條產生持續(xù)的收縮，不同濃度TG引起的腸肌同步收縮反應張力顯著不同。在無鈣Krebs液(包含1mmol·L-1EDTA)中用TG將肌條培養(yǎng)35min后，再加入Ca

8、2+(2.5mmol·L-1)，比未經TG處理的肌條產生的收縮張力明顯提高(99±28％vs70±8％)，且TG耗竭胞內鈣庫后再復鈣所致的收縮效應，不受L型鈣通道阻斷劑Ver影響，但可被SOCC阻斷劑La3+減弱。提示TG耗竭胞內鈣庫后再復鈣誘導的大鼠遠端結腸平滑肌收縮反應由CCE介導，由此推測CCE是大鼠遠端結腸平滑肌收縮的激活信號Ca2+的來源之一，參與完成結腸平滑肌興奮-收縮耦聯過程。 3CCE參與ACh誘導的大鼠遠端結腸

9、平滑肌收縮 以無鈣的Krebs液灌流或用EGTA螯合細胞外Ca2+后，高K+及ACh引起的遠端結腸平滑肌收縮幾乎完全消失。電壓操縱性Ca2+通道阻斷劑Ver也能減弱高K+及ACh引起的遠端結腸平滑肌收縮，其減弱的程度分別為74％，41％。此外，在無鈣的Krebs液中，5μmol·L-1ACh可引起離體腸管瞬時性收縮，這是由SR釋放鈣所致，然后加入10μmol·L-1阿托品(atropine)，在此基礎上恢復細胞外Ca2+(2.5

10、mmol·L-1)，則出現持續(xù)性收縮，待收縮反應達峰值時，加入5μmol·L-1Ver，收縮無明顯變化，且該收縮反應對SOCC阻斷劑La3+敏感，分別應用20μmol·L-1，50μmol·L-1和100μmol·L-1的La3+使上述收縮張力降低15％，23％和36％，且呈濃度依賴性，但對Cd2+則不敏感。研究結果提示，細胞外Ca2+內流對高K+及ACh誘導的離體遠端結腸平滑肌持續(xù)性收縮是必需的，由ACh誘導的遠端結腸平滑肌收縮至少包

11、括SR釋放鈣引起的短暫性收縮及受體操縱性Ca2+通道(receptor-operatedCa2+channel，ROCC)、VOCC和CCE介導的胞外Ca2+內流等途徑。 總之，在大鼠遠端結腸平滑肌細胞上，存在由胞內鈣庫耗竭激活的SOCC，為支持在興奮性細胞上存在CCE提供了實驗依據。目前推測，瞬時受體電位(transientreceptorpotential，TRP)蛋白家族中的成員組成了SOCC。本研究證明CCE是結腸平滑肌

12、收縮的激活信號Ca2+的來源之一，參與完成結腸平滑肌興奮-收縮耦聯過程，在影響和調節(jié)結腸平滑肌動力變化的信號轉導中起重要作用，我們還發(fā)現細胞外Ca2+對高K+及ACh介導的結腸平滑肌收縮反應是必需的，ACh誘導的結腸平滑肌收縮反應至少包括SR釋放鈣引起的短暫性收縮及ROCC、VOCC和CCE介導的胞外Ca2+內流引起的收縮反應等途徑。經研究結果將從通道水平進一步分析消化管平滑肌收縮的機制和特征，為預防和控制因胃腸動力紊亂所致的消化管疾病