DNA復制起始蛋白Cdc6——去甲斑蝥素的抗腫瘤作用靶點.pdf

1、研究背景與目的 斑蝥素是中藥斑蝥的提取物，具有抑制腫瘤細胞生長的作用，表現出抗腫瘤活性。但因其毒性較大，主要為泌尿和消化系統(tǒng)刺激癥狀，限制了其廣泛應用。去甲斑蝥素(Norcantharidin，NCTD)是斑蝥素的去甲衍生物，其毒性大大減弱，而抗腫瘤活性與斑蝥素相似，目前被用于治療肝臟腫瘤，慢性肝炎，以及白血病。但其具體作用機制還不清楚。NCTD可以誘導腫瘤細胞凋亡，這些腫瘤細胞包括K562，MCF，HeLa，T淋巴細胞白血病細

2、胞株6T-CEM，以及肝癌細胞株BEL-7402等；既往的研究發(fā)現，NCTD可以抑制腫瘤細胞的DNA的復制，從而抑制腫瘤細胞的生長；近來研究證實NCTD可以抑制PP2A的活性，重新引起了人們對斑蝥素及其衍生物尤其是NCTD的關注。但是目前對于NCTD抗腫瘤作用的研究大多只是停留在現象的觀察，對于其作用的分子機理研究不多，NCTD作用的確切靶點尚有待探討。 在真核細胞中，DNA的復制受到精確的調控，一旦起始DNA復制，必須保證所有

3、的DNA都被復制，而且在一次細胞周期中只復制一次。復制前復合體(prereplicationcomplex，Pre-RC)的形成和解體，在調控DNA的精確復制過程中發(fā)揮重要作用。DNA的復制需要在起始位點(Origin)組裝形成Pre-RC，包括：ORC、Cdc6、Cdt1和MCM2-7，這些蛋白相繼組裝在Origin上一起構成pre-RC，pre-RC組裝完成后，Origin便具備了起始DNA轉錄的能力。其中Cdc6蛋白對于完成pre

4、-RC的組裝至關重要，抑制Cdc6會阻礙DNA的合成；而過表達Cdc6會導致在一個細胞分裂周期內出現重復的DNA復制。但是Origin具備了起始轉錄的能力并不等于立即就可以開始轉錄，Origin的激活是以完成pre-RC到pre-IC組裝的過渡為標志的，Cdc45被招募組裝到Origin是完成pre-IC的標志，Cdc45對于激活起始DNA的復制具有至關重要的作用，Cdc45可作為一個橋梁，連接pre-RC與其他DNA復制所需要的蛋白。

5、 一些實驗證實在一些腫瘤細胞中Cdc6、Cdc45的表達比正常細胞偏高，這些蛋白因子對于腫瘤細胞的惡性增殖具有重要作用。最近有人提出Cdc6的異常表達具有癌基因的功能，可直接抑制INK4/ARF基因座位(編碼抑癌基因p15INK4b，p16INK4a和ARF)促進細胞的惡性轉化。DNA復制調節(jié)蛋白，尤其是Cdc6與腫瘤的關系越來越受到人們的關注。因其在DNA復制調節(jié)中的關鍵作用及腫瘤組織中的特異性增高，抑制其功能有可能在殺傷腫瘤

6、細胞的同時而對正常細胞影響較小，Cdc6有可能成為一個有效的、特異性強的抗癌靶點。 本研究的目的是：明確NCTD對DNA復制起始蛋白的影響，進一步闡明NCTD的抗腫瘤作用機理；明確DNA復制起始蛋白作為靶點在腫瘤治療中的意義。 方法及結果 (1)NCTD對腫瘤細胞的增殖抑制作用方法：采用MTT方法檢測NCTD對HL-60、KB、Ramos、Jurkat、Lovo、CNE2、HepG2細胞的增殖抑制作用。

7、結果顯示：NCTD對以上幾種腫瘤細胞均有增殖抑制作用，顯示出良好的抗腫瘤活性。對不同腫瘤細胞抑制作用強度有所差別，以對HL-60抑制作用較強.。IC50分別為：HL-60細胞42.46±0.49μM、Jurkat細胞62.46±0.63μM、HepG2細胞65.82±2.39μM、KB細胞74.09±1.45μM、Ramos細胞69.83±7.91μM、Lovo細胞130.4±21.8μM、CNE2細胞133.5±6.62μM。

8、 (2)NCTD對HL-60細胞DNA復制的抑制作用方法：采用3H-TdR摻入抑制實驗檢測了NCTD對HL-60細胞DNA復制的影響。 結果顯示：不同濃度的NCTD(0-128μM)作用于HL-60細胞12h后，其3H-TdR摻入量明顯降低。未加藥處理組c.p.m.值為13402±194.21；加藥組的c.p.m.值隨加藥濃度的升高逐漸下降，最高藥物濃度(128μM)下c.p.m.值為2643±362.97。 (3)NC

9、TD對腫瘤細胞DNA復制起始蛋白表達的影響方法：采用WesternBlot方法檢測了NCTD(0-100μM)作用后DNA復制起始蛋白Cdc6和Cdc45蛋白表達的變化。 結果表明：NCTD作用后Cdc6蛋白被裂解成49KDa的片斷，裂解效果呈現時間與劑量依賴性。隨著NCTD劑量的增加對Cdc6的裂解作用越明顯；且隨著作用時間的延長，Cdc6包括49KDa的片斷，被完全降解。通過分離提取細胞染色質組分蛋白發(fā)現，與染色質結合的Cd

10、c6也被裂解。NCTD對Cdc45蛋白水平及染色質定位不產生影響。 (4)NCTD誘導的Cdc6裂解作用中泛素依賴的蛋白酶體或Caspase-3機制的參與？ 方法：我們分別應用了泛素依賴蛋白酶體的特異性抑制劑MG132和Caspase-3的特異性抑制劑Ac-DEVD-cho，觀察其對NCTD誘導的Cdc6裂解的影響。 結果：泛素依賴的蛋白酶體抑制劑MG132(10μM)不能抑制NCTD誘導的Cdc6的裂解，相反與

11、NCTD單獨作用相比，MG132與NCTD聯合可導致更明顯的Cdc6的裂解，而且MG132單獨作用也可誘導Cdc6的裂解。在NCTD前2h加入Caspase-3特異性抑制劑Ac-DEVD-cho可以抑制NCTD誘導的Cdc6的裂解，Ac-DEVD-cho單獨作用對Cdc6沒有影響。 另外，采用Caspase-3酶活性檢測試劑盒檢測了NCTD作用后HL-60細胞Caspase-3活性的變化，結果發(fā)現NCTD作用Caspase-3酶

12、活性明顯增強。 (5)NCTD對HL-60細胞周期阻滯及凋亡的影響 方法：采用Hoechst33258染色、DNA瓊脂糖凝膠電泳和流式細胞儀技術檢測了NCTD作用后HL-60細胞凋亡特征的出現。WesternBlot檢測了Bcl-2、Cdc25C、Cdk1和CyclinB1蛋白表達的影響。 Hoechst33258染色結果：對照組細胞核形態(tài)完整、染色均勻，50μMNCTD處理HL-60細胞12h后，細胞核出現濃縮

13、、顆?；⒂械蛲鲂◇w出現。 DNA瓊脂糖電泳結果：顯示有DNA梯狀條帶出現。 流式細胞儀檢測結果：50μM的NCTD可誘導HL-60細胞逐漸阻滯于G2/M期，至24h到達高峰，并且隨著NCTD作用時間的延長，亞G1期細胞比例逐漸升高，至48h到達高峰(43.8％)。 WesternBlot結果：NCTD可下調Cdc25C、Cdk1和CyclinB1蛋白水平；Bcl-2蛋白表達不受影響。 (6)抑制Cdc6

14、對腫瘤細胞生長的抑制作用方法：構建靶向于cdc6的RNAi質粒，脂質體介導轉染HL-60細胞后，細胞周期分析及DNA瓊脂糖電泳檢測細胞的凋亡變化，MTT法檢測細胞活力。 結果：構建的RNAi質粒pENTR-cdc6轉染HL-60細胞后，可有效的沉默cdc6基因，使cdc6的mRNA和蛋白水平下調。沉默cdc6后，細胞周期結果顯示細胞出現亞G1期阻滯(21.2％)，DNA瓊脂糖電泳顯示有DNA梯狀帶出現。沉默cdc6使HL-60細

15、胞增殖受到抑制(P＜0.05)，與NCTD聯合作用比NCTD單獨作用抑制效果更強(P=0.024)。 結論 (1)NCTD可誘導腫瘤細胞Cdc6蛋白裂解，產生一約49KDa的小片斷；與染色質結合的Cdc6也被裂解，從而阻礙pre-RC的形成，從起始階段抑制DNA的復制。 (2)NCTD誘導的Cdc6的裂解依賴于Caspase-3的活性，同時NCTD可激活Caspase-3并誘導HL-60細胞凋亡。 (3)