中華倒刺鲃神經肽Y的cDNA克隆與序列分析.pdf

1、神經肽Y(NeuropeptideY，NPY)是一種由36個氨基酸組成的多肽，廣泛分布于中樞神經系統(tǒng)和外周神經系統(tǒng)中，尤其在端腦、視前區(qū)、視頂蓋以及下丘腦含量豐富。NPY與攝食行為、血壓、生物節(jié)律性、呼吸調節(jié)、下丘腦神經內分泌功能以及血管收縮，平滑肌舒縮等重要的生理過程的調節(jié)密切相關。中華倒刺鲃(Barbodes(Spinibarbus)smensis)，主要分布于長江中上游的干、支流水域中，是我國名貴淡水野生經濟魚類，具有巨大的養(yǎng)殖開

2、發(fā)前景。NPY是一種十分重要的采食量調控因子，但目前還沒有研究從分子水平具體闡明NPY對中華倒刺鲃攝食的作用機制，研究中華倒刺鲃NPY基因可以填補中華倒刺鲃NPY研究的欠缺，為進一步探討NPY在促進中華倒刺鲃攝食上發(fā)揮的作用建立一定的分子生物學基礎，以期為中華倒刺鲃等名優(yōu)魚類的養(yǎng)殖過程中的生物飼料技術提供理論或現(xiàn)實基礎，同時該研究對于闡明脊椎動物NPY基因的分子進化也有一定的學術意義。 本研究運用RACE技術克隆了中華倒刺鲃NP

3、Y基因，并對其核苷酸序列及推導的氨基酸序列以及預測的蛋白質高級結構進行了分析，主要研究結果如下： 1.中華倒刺鲃NPY基因全長cDNA序列 在對多種鯉科魚類的NPY基因進行了多重比對后設計了兩條特異性3'RACE引物，以來自中華倒刺鲃腦組織的mRNA為模板擴增得到了中華倒刺鲃NPY3'端序列。根據(jù)得到的3’端序列設計了一條特異性反轉錄引物和三對5'RACE特異性引物，從而得到了中華倒刺鲃NPY的5’端序列。分別從得到的3

4、’端序列和5’端序列設計特異性引物擴增中華倒刺鲃NPY全長cDNA。中華倒刺鲃NPY全長cDNA為774bp，5'UTR長為65bp，編碼區(qū)包括291個核苷酸，編碼一個長96個氨基酸殘基的蛋白質前體，3'UTR長為418bp。 2.中華倒刺鲃基因推導氨基酸序列的分析 中華倒刺鲃NPY的cDNA編碼區(qū)核苷酸長度為291bp，編碼96個氨基酸，由信號肽(28個氨基酸)、NPY成熟肽(36個氨基酸)、三肽加工位點(3個氨基酸)

5、和連接肽(29個氨基酸)組成。其基因基本結構和從其它脊椎動物中克隆的NPY的基因結構一致。 3.中華倒刺鲃NPY基因的同源性分析 中華倒刺鲃NPY的核苷酸序列與許多動物的NPY基因具有較強的相似性。尤其是在保守區(qū)內。比如其2bp-540bp、683bp-754bp和76bp-654bp區(qū)段與鯉魚(Cyprinuscarpio)的NPY基因(AF287347)的5bp-553bp、659bp-730bp和563bp-641

6、bp區(qū)段分別有95﹪、93﹪和91﹪的一致性，在DNAMAN軟件上對這兩者的cDNA全序列進行序列比對，結果表明，這兩個基因在整體分子水平上有86.5﹪的核苷酸一致性。中華倒刺鲃NPY的cDNA序列的編碼區(qū)與鯉魚(Cyprinuscarpio)、金魚(Carassiusauratus)、斑馬魚(Daniorerio)NPY的cDNA序列的編碼區(qū)的一致性為97.25﹪、95.56﹪、91.75﹪，全序列的一致性為85.6﹪、47.3﹪、5

7、2.21﹪。 中華倒刺鲃NPY在氨基酸水平的同源性高于核苷酸水平的同源性。中華倒刺鲃NPY前體氨基酸與鯉魚(Cyprinuscarpio)、金魚(Carassiusauratus)、斑馬魚(Daniorerio)等鯉科魚類NPY前體氨基酸之間的相似性很高，分別為97﹪、97﹪、95﹪；與其它硬骨魚類如虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、舌齒鱸(Dicentrarchuslabrax)、斜帶石斑魚(Epinephelus

8、coioides)的相似性分別為78﹪、76﹪、77﹪，而與兩棲類的光滑爪蛙、哺乳類的綿羊以及人的相似性分別為77﹪、83﹪、78﹪。 將幾種代表不同脊椎動物類群的NPY前體氨基酸序列運用軟件比較發(fā)現(xiàn)：不同物種間NPY的相似性很高，尤其是由36個氨基酸編碼的NPY成熟肽之間的相似性更高。不同物種間NPY的比對結果表明，NPY前體的成熟肽和蛋白水解位點是十分保守的，而信號肽和連接肽有較大的變異。由此可以推測NPY是一個比較古老的分

9、子，不同物種間的NPY可能是由相同的祖先進化而來的，在長期的進化過程中NPY成熟肽及蛋白水解位點序列進化很保守，而在不同進化分支脊椎動物之間，NPY信號肽和連接肽的氨基酸序列變化較大，這可能與不同物種在長期的自然選擇壓力有關。 4.中華倒刺鲃NPY基因推導蛋白的分析及其結構預測 預測NPY基因編碼一個96個氨基酸的多肽鏈，分子量Mw=11.0046kDa，等電點pI=5.59。在氨基酸組成上，亮氨酸(Leu)是含量最高的

10、氨基酸(11.46﹪)；其次是丙氨酸(Ala)，占8.33﹪；再次是谷氨酸(Glu)和蘇氨酸(Thr)，均占7.29﹪；含量最低的氨基酸是半胱氨酸(Cys)、苯丙氨酸(Phe)和纈氨酸(Val)，均為2.08﹪。從整體上來看，堿性氨基酸(賴氨酸Lys、精氨酸Arg)和酸性氨基酸(天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu)分別占9.38﹪和12.5﹪，酸性氨基酸含量的偏高是導致其等低等電點的原因。該蛋白質的二級結構主要有四種形式組成，及α-螺旋、隨機