Trx-ASK1在Doxorubicin誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、第一部分 Doxorubicin誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞凋亡以及抗氧化劑Ebselen的保護(hù)作用
　　目的：
　　通過(guò)給予doxorubicin體外誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，并檢測(cè)這一過(guò)程中Caspase3、PARP-1的活化，給予抗氧化劑Ebselen后是否可以抑制doxorubicin誘導(dǎo)的凋亡。
　　方法：
　　一、培養(yǎng)第四天的乳鼠心肌細(xì)胞給予不同濃度的doxorubicin作用24h，MTT法檢測(cè)心肌細(xì)胞的存活率

2、;凋亡試劑盒檢測(cè)caspase3的活性；western-blot法檢測(cè)Cleaved PARP-1的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)分組為：1、正常組(Con)：正常培養(yǎng)24h；2、0.1μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、5μmol/L DOX組：正常細(xì)胞分別給予上述濃度DOX培養(yǎng)24h。
　　二、培養(yǎng)第四天的乳鼠心肌細(xì)胞預(yù)孵育Ebselen2 h,給予1μmol/L DOX作用24h，MTT法檢測(cè)心肌細(xì)胞的存活率;細(xì)胞內(nèi) ROS含量檢

3、測(cè)；細(xì)胞凋亡熒光Hochest33258試劑盒進(jìn)行凋亡檢測(cè)；凋亡試劑盒檢測(cè)caspase3的活性；western-blot法檢測(cè)PARP-1、Cleaved PARP-1的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)分組：1、正常組(Con)：正常培養(yǎng)24h；2、1μmol/L DOX組：正常細(xì)胞給予1μmol/L DOX培養(yǎng)24h；3、1μmol/L DOX+50μmol/L Ebselen組：預(yù)孵育50μmol/L Ebselen2h,給予1μmol/L DOX作用

4、24h;4、給予50μmol/L Ebselen24h。結(jié)果：
　　1.乳鼠心肌細(xì)胞給予不同濃度的doxorubicin作用24 h后，MTT法檢測(cè)心肌細(xì)胞的存活率呈現(xiàn)劑量依賴性，1μmol/L與5μmol/L DOX組 MTT值下降，與對(duì)照組MTT值比較均有顯著差異（P<0.01）。
　　2.24h后檢測(cè)胞漿caspase3活性,與con組相比，1μmol/L DOX組caspase3活化度為151.23±10.41％（P

5、<0.01）;5μmol/L DOX組caspase3活化度為161.03±12.21%（P<0.01）。
　　3.24h后檢測(cè)Cleaved PARP-1的表達(dá)。與con組相比，1μmol/L和5μmol/L DOX組Cleaved PARP-1表達(dá)明顯增加（P<0.001）。
　　4.預(yù)孵育50μmol/L Ebselen2h,給予1μmol/L DOX。24h后，檢測(cè)細(xì)胞活力。1μmol/L DOX組MTT值下降，與對(duì)

6、照組MTT值比較有顯著差異（P<0.01）；Ebselen可以顯著抑制 DOX對(duì)細(xì)胞的損傷，與 DOX組比較 MTT值比較有顯著差異（P<0.05）。
　　5.預(yù)孵育50μmol/L Ebselen2h,給予1μmol/L DOX。24h后，加入熒光探針H2DCFDA孵育30 min清洗后觀察，DOX組比con組細(xì)胞內(nèi)單位面積熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，證實(shí)有ROS的減產(chǎn)生，給予Ebselen后，ROS含量減少。
　　6.預(yù)孵育50μ

7、mol/L Ebselen2h,給予1μmol/L DOX。24h后，Hochest33258熒光染色。con組細(xì)胞呈低藍(lán)色，1μmol/L DOX組細(xì)胞呈高藍(lán)色，亮度明顯增高，可觀察到明顯的細(xì)胞核固縮，具有凋亡的顯著特征，與DOX組相比，Ebselen組凋亡有所改善。
　　7.預(yù)孵育50μmol/L Ebselen2h,給予1μmol/L DOX24h后，檢測(cè)胞漿caspase3活性。與con組相比，1μmol/L DOX組ca

8、spase3活化度為171.04±10.41%（P<0.01）;與DOX組相比，Ebselen可以顯著抑制caspase3的活化125.04±6.41%，（P<0.05）。
　　8.預(yù)孵育50μmol/L Ebselen2h,給予1μmol/L DOX24h后，檢測(cè)Cleaved PARP-1的表達(dá)。與con組相比，1μmol/L DOX組Cleaved PARP-1表達(dá)明顯增加（P<0.001）;與DOX組相比，Ebselen組

9、Cleaved PARP-1表達(dá)明顯減少（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　給予 DOX作用乳鼠心肌細(xì)胞，細(xì)胞的存活率呈現(xiàn)劑量依賴性；細(xì)胞內(nèi) ROS含量顯著增加；形態(tài)學(xué)觀察到顯著的凋亡特征；Caspase3活性顯著升高；PARP-1蛋白的剪切片段表達(dá)較正常組顯著增加，給予抗氧化劑Ebselen后，與DOX組相比，凋亡得到了改善。
　　第二部分 Doxorubicin誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究
　　目的：

10、r>　　檢測(cè)DOX誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中Trx-ASK1是否發(fā)生了分離；以及發(fā)生分離后ASK1是否發(fā)生了活化，并進(jìn)而啟動(dòng)ASK1介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路。
　　方法：
　　一、培養(yǎng)第四天的乳鼠心肌細(xì)胞預(yù)孵育Ebselen2h,給予1μmol/L DOX作用24h,免疫沉淀法檢測(cè)Trx-ASK1的結(jié)合率。實(shí)驗(yàn)分組為：1、正常組(Con)：正常培養(yǎng)24h；2、1μmol/L DOX組：正常細(xì)胞給予1μmol/L DOX培養(yǎng)24h；3、

11、1μmol/L DOX+50μmol/L Ebselen組：預(yù)孵育50μmol/L Ebselen2h,給予1μmol/L DOX作用24h;4、給予50μmol/L Ebselen24h。
　　二、培養(yǎng)第四天的乳鼠心肌細(xì)胞預(yù)孵育Ebselen2h,給予1μmol/L DOX作用24h，western-blot法檢測(cè)p-ASK1、p-p38、p38的表達(dá)。。實(shí)驗(yàn)分組：1、正常組(Con)：正常培養(yǎng)24h；2、1μmol/L DOX

12、組：正常細(xì)胞給予1μmol/L DOX培養(yǎng)24h；3、1μmol/L DOX+50μmol/L Ebselen組：預(yù)孵育50μmol/L Ebselen2h,給予1μmol/L DOX作用24h;4、給予50μmol/L Ebselen24h。
　　結(jié)果：
　　1.心肌細(xì)胞給予1μmol/L DOX作用后，與正常組比較Trx-ASK1發(fā)生了顯著的分離（P<0.001）；與1μmol/L DOX組相比，1μmol/L DOX+

13、50μmol/L Ebselen組Trx-ASK1分離顯著減少（P<0.05）。
　　2.心肌細(xì)胞給予1μmol/L DOX作用后，與正常組比較p-ASK1ser967的表達(dá)顯著減少(P<0.01），與 DOX組相比，1μmol/L DOX+50μmol/L Ebselen組p-ASK1ser967表達(dá)顯著增加（P<0.01）。
　　3.心肌細(xì)胞給予1μmol/L DOX作用后，與正常組比較 p-p38表達(dá)顯著增加（P<0.