采用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)進行乳腺癌細胞因子篩選及IL-8在乳腺癌侵襲和血管生成中作用的研究.pdf

1、目的:利用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)鑒定人類乳腺癌進展中的關(guān)鍵因子.運用人類細胞抗體芯片技術(shù)分析11株人類乳腺癌細胞的細胞因子表達譜,并進一步研究細胞因子在乳腺癌進展中的作用機制.研究內(nèi)容和方法:研究材料包括11種乳腺癌細胞株:MDA-MB-231、MDA-MB-157、MDA-MB-468、SKBr-3、BT-20、BT-474、BT-549、T47D、ZR75-1、Hs587T、MCF-7細胞株以及35種細胞因子.第一部分蛋白質(zhì)芯片技術(shù)分析乳腺

2、癌細胞的細胞因子表達譜.開始實驗前收集細胞培養(yǎng)上清液.將培養(yǎng)細胞用磷酸鹽緩沖液洗滌,以0.25％胰酶/EDTA消化后,按1×10<'6>個細胞/盤密度培養(yǎng)于100mm的細胞培養(yǎng)盤內(nèi).細胞首先在8ml含有10%FCS的DMEM培養(yǎng)液中增殖48小時,PBS洗滌細胞兩次,更換8ml含有0.2%牛血清的DMEM培養(yǎng)液.48小時后,收集細胞上清液,離心1000g去除細胞碎片,分裝并儲存于一80℃,直至進一步的實驗.同時,收集細胞并測定蛋白質(zhì)濃度,

3、實驗時根據(jù)細胞蛋白質(zhì)濃度標化細胞上清液.第二部分IL-8在乳腺癌細胞侵襲、血管生成和增殖中的作用.乳腺癌細胞體外侵襲能力的測定在重建基底膜的12孔板Transwell小室中進行.Matrigel 30μl用不含血清的DMEM培養(yǎng)基1:1稀釋(總量60μl),加入Transwell小室的多孔聚碳酯膜上表面(膜孔徑12.0 μm),室溫下通風櫥中干燥1小時.將不同細胞株的細胞用PBS洗3次,消化后重懸于含10%FCS的DMEM培養(yǎng)基中,取4

4、×10<'5>/ml細胞0.5ml加入至上室,1.5ml 10%FCS的DMEM培養(yǎng)基加入下室.37℃、5%C0<,2>條件下培養(yǎng)24小時,4%甲醇固定后行Gimsa染色.去除濾膜上層細胞,顯微鏡下(×320)計數(shù)濾膜下表面的侵襲了基底膜的細胞數(shù),隨機計數(shù)5個視野中的細胞數(shù)目,以侵襲細胞的相對數(shù)目來表示腫瘤細胞的侵襲能力.第三部分ER對乳腺癌細胞IL-8的表達調(diào)控研究.利用細胞上清液芯片實驗檢測MDA-MB-231細胞和ER-α轉(zhuǎn)染的M

5、DA-MB-231細胞IL-8的表達差異.4℃下將40μg/ml的抗IL-8抗體包被hybond ECL膜4小時,室溫干燥.接著,將0.2μ1不同來源的細胞上清點樣于膜上.細胞上清液膜在5%BSA/TBS中封閉非特異性位點1小時后,與生物素標記的抗IL-8抗體混合液孵育1.5小時.經(jīng)過3次0.1%Tween20/TBS和2次TBS震蕩洗滌,最后將芯片膜與2.5ng/ml HRP-Streptavidin孵育1小時.同樣的洗滌條件去除未結(jié)

6、合的HRP-Streptavidin.ECL法顯示信號.β-雌二醇實驗是在MDA-MB-231原代細胞和S30培養(yǎng)基中加入2nM β-雌二醇,收集細胞上清液并進行細胞上清液芯片實驗.采用FuGENE 6轉(zhuǎn)染法將ER-α及IL-8啟動子pN1481 Luc或p Luc0轉(zhuǎn)染至人類乳腺癌細胞,同時共轉(zhuǎn)染HSV-TK表達質(zhì)粒pRL-TK作為測定轉(zhuǎn)染效率的內(nèi)參對照.雙熒光素酶報告基因檢測ER-α對IL-8啟動子的調(diào)控作用.結(jié)論:1.人類乳腺癌細