耶爾森氏菌蛋白在促甲狀腺素受體自身抗體產(chǎn)生中分子模擬機制的研究.pdf

1、甲狀腺是人體的重要內(nèi)分泌器官，它分泌的多種激素參與人體糖、脂和蛋白質以及鈣等物質的代謝調(diào)控，特別是甲狀腺激素，是維持人體正常代謝的核心激素之一。由于這些激素功能的重要性，因此它們的產(chǎn)生和活性都有高度受控的反饋調(diào)節(jié)機制來保持其正常。這些機制主要包括：下丘腦產(chǎn)生甲狀腺釋放激素(TRH)從而刺激垂體產(chǎn)生甲狀腺刺激激素(TSH)，TSH再與甲狀腺濾泡細胞上的甲狀腺刺激激素受體(TSHR)結合，從而刺激甲狀腺激素的產(chǎn)生，這是一種正反饋機制；另外是

2、一種負反饋機制，即甲狀腺產(chǎn)生的游離甲狀腺激素T3能夠通過血液循環(huán)作用于下丘腦和垂體，從而反饋抑制TRH和TSH產(chǎn)生的。通過這兩種機制來調(diào)控甲狀腺激素維持在正常水平，既不太多，也不太少，從而發(fā)揮正常的調(diào)控作用。有很多原因能夠引起自身免疫功能的異常，從而破壞這一精細的調(diào)控機制而導致甲狀腺激素過多或過少，最終產(chǎn)生甲狀腺機能亢進或甲狀腺機能減退。由自身免疫原因引起的甲狀腺疾病即稱為自身免疫性甲狀腺疾病，它們的共同特征是存在針對多種甲狀腺抗原的自

3、身抗體，如TG、TPO和TSHR，而這些蛋白是甲狀腺激素產(chǎn)生過程中的關鍵蛋白。
　　 Graves′disease(GD)是一種常見的器官特異性自身免疫疾病，與橋本氏甲狀腺炎(HT)和特發(fā)性粘液性水腫(PM)一樣都是自身免疫性甲狀腺病(AITD)的主要類型，發(fā)病率在0.3‰左右，尤以年輕女性多發(fā)。AITD都存在不同程度甲狀腺組織的淋巴細胞浸潤；在病人的血清中都存在甲狀腺組織特異的自身抗體，主要包括抗甲狀腺球蛋白抗體(TGAb)、

4、抗甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAb)和抗促甲狀腺激素受體抗體(TRAb)三種，就某種特定疾病而論，超過90％的Graves病(GD)病人存在抗TSHR的自身抗體，接近80％的Graves病(GD)病人存在抗TPO的自身抗體；而超過90％的HT病人有anti-TPO和/或anti-TG的自身抗體。但與anti-TSHR抗體不同，anti-TPO和anti-TG抗體在HT或GD的發(fā)病機制中并沒有重要意義，但它們能夠幫助人們進行鑒別診斷和判斷

5、預后。而TRAb在GD、PM和部分HT患者血清中的陽性檢出率可高達80％～100％，被認為是導致AITD，特別是GD發(fā)病的主要病因和自身抗原，是GD最重要的標志物。作為一種典型的自身免疫性疾病，GD發(fā)病機制復雜，特別是TSHR的免疫耐受如何被破壞從而產(chǎn)生TRAb這一過程的確切機制目前仍不明確?，F(xiàn)在人們普遍認為遺傳因素(HLA-DR，MHC，CTLA-4和PTPN22等)在這一過程中發(fā)揮重要作用；但很多證據(jù)也表明遺傳因素并非是導致自體免疫

6、耐受被破壞而產(chǎn)生抗TSHR抗體從而導致GD發(fā)生的唯一原因，感染、輻射、飲食和精神等眾多環(huán)境因素在機體對甲狀腺組織免疫耐受異常、產(chǎn)生TRAb等自身抗體而發(fā)病的過程中也發(fā)揮重要作用。但這些因素通過何種機制，如何導致免疫系統(tǒng)攻擊原本免疫耐受的自體組織器官而導致發(fā)病的具體環(huán)節(jié)目前仍不清楚。在這些環(huán)境因素中，感染是眾多自身免疫疾病的重要病因，目前認為其破壞免疫耐受的重要機制之一就是因細菌、病毒等外來抗原與某些自身組織存在交叉免疫原性，免疫系統(tǒng)產(chǎn)生

7、的針對外來抗原的抗體就會通過分子模擬機制而使原本免疫耐受的自身組織遭到免疫系統(tǒng)攻擊。此外還有細菌超抗原活化多克隆T細胞；甲狀腺等組織內(nèi)HLA分子表達增強等破壞自身免疫耐受的機制。
　　 小腸結腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica，YE)是一種常見的感染因素，有腹瀉、心肌炎、反應性關節(jié)炎和結節(jié)性紅斑等腸道內(nèi)外癥狀。70年代人們發(fā)現(xiàn)GD患者中YE抗體(YEAb)的陽性率與正常對照和非GD組相比明顯增高，YE

8、菌體蛋白有穩(wěn)定的TSH結合位點，而且能夠被GD病人免疫球蛋白所識別和結合。我們之前對403例GD患者的研究也發(fā)現(xiàn)63％的GD患者伴YE引發(fā)的腹瀉，應用YE敏感的抗生素治療后，70％的GD患者腹瀉緩解，同時GD病情和復發(fā)率也明顯降低，這些證據(jù)都提示YE與GD關系密切。之前已有研究認為YE的包膜蛋白和脂蛋白與TSHR存在交叉免疫原性，但未能指出是那一種具體的蛋白以及蛋白上被TRAb所識別的具體的抗原表位。盡管與YE感染在GD發(fā)病中作用有關的

9、研究已進行了35年，但目前仍未有定論，很多問題仍未能闡明：如YE中有那些蛋白與GD有關；這些蛋白及其不同抗原表位所對應的抗體是否影響甲狀腺功能，它們單獨或與TSHR抗原表位聯(lián)合免疫動物后能否導致甲狀腺功能異常等。因此更多揭示YE中能夠被TRAb識別且其抗體具有功能意義的蛋白、該蛋白上功能相關的抗原表位和其可能的致GD作用，以及它們與其它TSHR抗原表位的關系將有助于人們對YE與GD關系和GD發(fā)病機制的深入理解，也有助于對GD的診斷及預后

10、判定、免疫干預治療；而且，對人們深入理解免疫耐受形成和破壞的機制、感染在糖尿病等其它與自體免疫密切相關的疾病中的作用，也具有重要的指導意義。
　　 技術的進步使我們除了噬菌體展示肽庫，肽探針掃描和x-ray/MRI技術等經(jīng)典表位作圖技術外，還能夠利用免疫蛋白組學的技術，更加方便和高效的確定YE中完全未知的TRAb抗原蛋白，并確定功能相關的抗原表位。在這些技術的幫助下，我們利用GD患者的血清以及多種抗原表位位于TSHR的ECD內(nèi)的

11、商業(yè)化單克隆抗體與YE總蛋白進行Western blot，發(fā)現(xiàn)在不同病人之間存在共同的陽性條帶，將該條帶剪切下來，經(jīng)膜上酶解和質譜鑒定后，發(fā)現(xiàn)該條帶是YE蛋白中理論分子量為42KD的外膜孔蛋白F(ompF)。在這一研究結果的基礎上，我們構建了它的表達載體，研究結果表明表達純化后的ompF蛋白不僅仍能與原單抗結合，也能被經(jīng)GD病人的抗血清所識別，這進一步確證了我們之前的研究結果。我們進一步利用蛋白抗原性分析的相應生物信息學工具，并在已知同

12、源蛋白空間結構的基礎上，通過蛋白空間結構同源建模工具得到了TSHR和ompF蛋白的空間結構，利用這些數(shù)據(jù)，我們經(jīng)過綜合分析發(fā)現(xiàn)ompF上至少存在5個潛在抗原表位，而且這些表位都在蛋白結構的表面，其中ompF上能夠被anti-hTSHRantibody所識別的抗原表位是位于190到197位間的氨基酸序列(DALGNVTS)。為了進一步檢測我們發(fā)現(xiàn)的ompF蛋白上這些與TSHR可能存在交叉免疫反應的抗原表位的功能意義，我們又進一步制備了om

13、pF相應抗原表位的多克隆抗體，發(fā)現(xiàn)該多克隆抗體能夠使人原代甲狀腺濾泡細胞和穩(wěn)定表達人TSHR的CHO細胞的細胞內(nèi)cAMP升高，具有一定的TSAb活性。然而，YE在GD發(fā)病中的作用是一個十分復雜的問題，仍需要在很多領域進行大量細致深入的研究，本研究的結果為進一步的深入研究提供了線索。以此為基礎，我們可以利用基于親和純化和質譜技術的epitope extraction和epitope excision技術對于ompF蛋白中能被anti-hT

14、SHR抗體所識別的抗原表位以及不同抗原表位所產(chǎn)生的抗體的功能意義進行更加精確和詳盡的研究。另外，ompF、lipoproteins，envelope proteins andYOP等已發(fā)現(xiàn)的與TSHR具有交叉免疫原性的YE蛋白在GD發(fā)病和誘導TRAb產(chǎn)生中的確切作用和相互關系也需要進一步的深入研究。只有在這些深入分子水平的研究的基礎上，才能明確YE在TRAb產(chǎn)生和GD發(fā)生和發(fā)展中的作用，對GD的診斷、預后及免疫干預治療都具有重要的意義，