大鼠神經(jīng)干細(xì)胞分化后GSK-3β、CDK-5和PP2A的表達(dá)及其調(diào)節(jié).pdf

1、目的： 本實(shí)驗(yàn)旨在探討大鼠神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化后GSK-3β、CDK-5和PP2A的表達(dá)以及Aβ<,25-5>和人參皂苷Rbl對它們的調(diào)節(jié)作用。 方法： 無菌條件下取新生24h大鼠海馬齒狀回分離培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，將第三代處于增殖期的神經(jīng)干細(xì)胞，體外培養(yǎng)并加血清及撤除有絲分裂原誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞，運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法檢測神經(jīng)干細(xì)胞特異性抗原Nestin和神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物NSE及GFAP以評價(jià)分化細(xì)胞的陽性率。本實(shí)驗(yàn)采

2、用分神經(jīng)干細(xì)胞分化后1w的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組：(1)正常組：不另加處理因素，繼續(xù)培養(yǎng)36h；(2)Aβ<,25～35>處理組：不加處理因素，培養(yǎng)24h后，加入凝聚態(tài)Aβ<,25～35>(20μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)12h；(3)人參皂苷Rbl預(yù)處理組：先加入人參皂苷Rbl(10μmol/L)預(yù)處理24h,再加入凝聚態(tài)Aβ<,25～35>(20μmol/L)繼續(xù)作用12h。統(tǒng)一收集各組細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測。采用：RT-PCR技術(shù)檢測神經(jīng)干細(xì)胞分化

3、過程中GSK-3β、CDK-5和PP2A的mRNA表達(dá)。同時應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)分析各組的細(xì)胞周期時相分布，觀察不同處理組的細(xì)胞增殖情況。另外，應(yīng)用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法觀察PP2A以及活化型GSK-3β(pTyr279,216)的表達(dá)。 結(jié)果： 1.自新生大鼠海馬齒狀回新鮮分離的單個神經(jīng)干細(xì)胞呈透亮的圓形，數(shù)量較少，雜質(zhì)較多。傳至第3代(約3w左右)神經(jīng)球明顯增大，雜質(zhì)已基本消除。細(xì)胞免疫化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記性蛋白N

4、estin在原代，傳代培養(yǎng)神經(jīng)球均有表達(dá)。神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化后3d，大多數(shù)懸浮狀態(tài)生長的神經(jīng)球開始貼壁，有的細(xì)胞呈毛刺狀向外爬行。誘導(dǎo)分化7d后，貼壁神經(jīng)干細(xì)胞團(tuán)中有大量細(xì)胞阿外遷移，并形成長突起，相互交織成網(wǎng)狀。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測顯示，誘導(dǎo)分化后的神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元特異性表面標(biāo)志NSE和星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性表面標(biāo)志GFAP。 2.流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期時相，結(jié)果顯示，Ap<,25～35>組和Rb1預(yù)處理組細(xì)胞均發(fā)生G0/G1期阻滯

5、，細(xì)胞增殖受到抑制，且Aβ<,25～35>組細(xì)胞增殖能力下降更明顯。 3.正常組細(xì)胞均有GSK-3β、CDK-5和PP2A的mRNA表達(dá)。Aβ<,25～35>組和Rb1預(yù)處理組都有強(qiáng)于正常組的GSK-3β和CDK-5的mRNA表達(dá)，且它們在Aβ<,25～35>組表達(dá)最強(qiáng)，統(tǒng)計(jì)分析有顯著性差異(p<0.01)；而PP2A的mRNA在Aβ<,25～35>組和Rb1預(yù)處理組的表達(dá)都低于正常組，在Aβ<,25～35>組的表達(dá)最弱，統(tǒng)計(jì)分

6、析有顯著性差異(p<0.01)。 4.免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示：正常組細(xì)胞有PP2A的表達(dá)，Aβ<,25～35>組和人參皂苷Rb1預(yù)處理組細(xì)胞PP2A的表達(dá)均減弱，其中Aβ<,25～35>組最弱；而Aβ<,25～35>組和人參皂苷Rb1預(yù)處理組細(xì)胞內(nèi)活化型GSK-3β(pTyr279，216)的表達(dá)均高于正常組，其中Aβ<,25～35>組表達(dá)最強(qiáng)。 結(jié)論： 1．體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞分化后有GSK-3β、CDK