表達致PWD和ED大腸桿菌保護性抗原基因的重組菌的中間試驗、環(huán)境釋放試驗及我國部分養(yǎng)殖豬種F18受體基因型的檢測.pdf

1、由產(chǎn)類志賀毒素大腸桿菌(SLTEC)引起的斷奶仔豬腹瀉(PWD)和仔豬水腫病(ED)是導致斷奶仔豬死亡的重要傳染病。該類大腸桿菌的致病性主要與粘附素和腸毒素/類志賀毒素兩類毒力因子有關。細菌通過粘附素附著于豬腸道上皮細胞，細菌一旦定居于小腸粘膜上，即開始大量繁殖，并產(chǎn)生大量的毒素或侵入深部，損傷破壞組織引發(fā)疾病。引起PWD的大腸桿菌主要產(chǎn)生F4[K88]和F18兩類粘附素，致ED的大腸桿菌可產(chǎn)生F18粘附素，致ED的大腸桿菌另一個顯著特

2、點是可產(chǎn)生志賀毒素2變異體(Stx2e)。迄今為止，如何有效預防PWD和ED仍然是有待解決的問題。本研究的目的是通過對本室構(gòu)建并已完成初步免疫效力研究的表達致PWD和ED大腸桿菌保護性抗原基因的重組菌在江蘇省的中間試驗和環(huán)境釋放試驗的研究，評價重組菌對豬的免疫效果及其安全性，為PWD和ED的基因工程疫苗的研制奠定基礎。 與F4粘附素生物合成有關的基因簇包括10個，其中faeG編碼的蛋白FaeG是F4粘附素的主要亞單位蛋白，與菌毛

3、的粘附特性有關；與Ⅰ型菌毛相似，F(xiàn)18也是由多個亞單位組成，現(xiàn)已鑒定的亞單位有A、E、F等，亞單位A(fedA)是F18粘附素的主要結(jié)構(gòu)亞單位；Stx2e由一分子的A亞單位和五分子的B亞單位的聚合體共同構(gòu)成，其中B亞單位主要與細胞受體結(jié)合有關，具有免疫原性。施慧等人構(gòu)建的重組菌BL21(pFSFaeG)有效表達了Stx2eB亞單位基因(stx2eB)、F18菌毛的A亞單位基因(fedA)和F4菌毛亞單位基因(faeG)，經(jīng)SDS-PAG

4、E和Western-blot試驗證實了其表達產(chǎn)物具有生物學活性。楊健美等在小鼠體內(nèi)研究了重組菌經(jīng)不同途徑(口服活菌、滅活菌體腹腔免疫)免疫后的抗體產(chǎn)生情況和免疫保護效果，發(fā)現(xiàn)口服使用時的效果并不理想，而滅活免疫能夠在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生穩(wěn)定上升的抗體，并在二免后7～21天達到并維持著較高的抗體水平，對毒株和毒素的攻毒保護均達到80％以上。 本研究將已鑒定的高效表達目的蛋白的重組菌經(jīng)誘導后與脫脂奶制成細菌膠囊進行活菌口服免疫或滅活后與白油

5、充分乳化制成油乳劑苗肌肉注射免疫，跟蹤檢測產(chǎn)生針對目的蛋白的特異抗體，評價其免疫效力，并跟蹤監(jiān)測其各項生產(chǎn)性能指標，評價其安全性。 此外本研究還對我國部分養(yǎng)殖豬種F18受體基因型進行了初步研究，為該病的防制與抗病育種提供了參考。 1.表達致PWD和ED大腸桿菌保護性抗原基因的重組菌BL21(pESFaeG)的中間試驗、環(huán)境釋放試驗按照農(nóng)業(yè)部《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價管理辦法》的要求，并經(jīng)農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理辦公室批

6、準，完成表達致PWD、ED大腸桿菌保護性抗原基因的重組菌在江蘇省的中間試驗和環(huán)境釋放試驗。已構(gòu)建的能表達致PWD和ED大腸桿菌保護性抗原FedA-Stx2eB-FaeG融合蛋白的重組菌BL21(pFSFaeG)，經(jīng)IPTG誘導的重組菌制成抗原，經(jīng)口服、滅活后與白油按一定比例制成油乳劑苗免疫試驗豬，并用間接ELISA法定期檢測豬血清中的抗體產(chǎn)生情況?？贵w檢測結(jié)果表明，重組菌滅活油苗3日齡免疫能夠誘導豬體產(chǎn)生針對上述三種保護性抗原的特異性I

7、gG抗體，并能長時間維持較高水平，而重組菌活菌口服免疫試驗豬所誘導的體液免疫、黏膜免疫水平低，效果較差。通過對免疫接種后試驗豬在增重、死淘率及其他性能方面與對照組的差異分析，重組疫苗免疫后能起到較好的免疫保護效果，且不會對試驗豬的生產(chǎn)性能造成不良影響。試驗全程的監(jiān)測表明重組疫苗免疫后在體內(nèi)對腸道其它正常菌群無明顯影響，不會向環(huán)境微生物轉(zhuǎn)移，對試驗場周邊的非靶動物也沒有致病性，證明重組菌應用于豬體預防PWD和ED是有效且安全的。

8、2.我國部分養(yǎng)殖豬種PWD、ED疑似病豬大腸桿菌F18受體基因型檢測 采用候選基因法和體外黏附試驗發(fā)現(xiàn)，α(1，2)巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因(FUT1)可作為豬產(chǎn)腸毒素大腸桿菌F18受體(ETECF18R)的候選基因。有關測序表明，在FUT1的307bp位點出現(xiàn)兩個多態(tài)型，與F18大腸桿菌所致的斷奶仔豬腹瀉和水腫病易感性相關。本文采集目前我國部分地區(qū)飼養(yǎng)的3個豬種的50頭疑似斷奶仔豬腹瀉和水腫病病豬的血液樣品，用PCR方法檢測這些個體的

9、ECF18R的基因型，同時采集糞樣進行細菌的分離鑒定。結(jié)果表明受檢的三個豬種的50頭病豬在FUT1基因M307位點均存在多態(tài)性，按AA、AG和GG三種基因型分布；19頭長大二元雜交豬和16頭三元雜交豬中，F(xiàn)UT1基因M307擴增產(chǎn)物酶切后均有個體產(chǎn)生三種類型的片段，且以敏感型(GG型和AG型)居多，平均占91％；而在15個含國內(nèi)地方血統(tǒng)的土雜豬中，只有兩種類型的片段。從50頭病豬分離到的50株大腸桿菌，測出了其中29個分離株的O血清型，