JBP485對刀豆球蛋白A導致的原代培養(yǎng)大鼠肝細胞損傷的保護作用研究.pdf

1、目的： 肝炎是嚴重危害人類生命健康的疾病，以病毒性肝炎為最多見。近年來自身免疫性肝炎也越來越多地受到人們的關(guān)注，這兩大類型肝炎的共同特征是免疫因素起主導作用，由于肝炎病毒蛋白在肝細胞表面的表達或自身抗體的出現(xiàn)，使淋巴細胞能夠識別殺傷自身肝細胞。JBP485(Cyclo-trans-4-L-hydroxyprolyl-L-serine，環(huán)反式-4 左旋-羥脯氨酰絲氨酸)是從人胎盤水解產(chǎn)物Laennec中提取出來的一種二肽，研究已證

2、實JBP485具有潛在的抗肝炎活性。本實驗通過體外方法研究JBP485的直接肝細胞保護作用及其可能的作用機制，為JBP485的開發(fā)應用提供新的實驗證據(jù)及理論依據(jù)。 方法： 取雌性Wistar大鼠肝細胞進行原代培養(yǎng)，構(gòu)建兩組體外肝細胞損傷模型及淋巴細胞增殖干預實驗，觀察JBP485對刀豆球蛋白A(Concanavalin A，Con A)導致的肝細胞損傷是否具有保護作用，同時觀察JBP485對淋巴細胞的增殖是否具有抑制作用

3、。(1)模型Ⅰ：采用50μg/ml Con A直接導致肝細胞損傷。分為對照組、模型Ⅰ組、JBP485處理組，每組設(shè)3個復孔。25μM JBP485與肝細胞溫孵1小時后加入50 μg/ml Con A。(2)模型Ⅱ：20μg/ml Con A預處理的肝細胞與20 μg/ml Con A預刺激的自體脾淋巴細胞進行共培養(yǎng)8小時。分為正常組、對照組、模型Ⅱ組、JBP485處理組，每組設(shè)3個復孔。25μM JBP485與肝細胞溫孵1小時后加入20

4、 μg/ml Con A作用24小時，脾淋巴細胞用Con A預刺激48小時，兩種細胞進行聯(lián)合培養(yǎng)之前分別清洗兩次，JBP485以同樣的濃度出現(xiàn)在共培養(yǎng)體系中。對于兩個模型組，作用時間結(jié)束后收集培養(yǎng)上清液測定谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)的活性及腫瘤壞死因子α(TNF-a)的含量；用瓊脂糖凝膠電泳進行DNA片段分析；用RT-PCR、細胞免疫化學法分析caspase-3的表達情況。(3)ICAM-1誘導/抑制實驗，把20μg/m

5、l Con A預刺激48小時的脾淋巴細胞培養(yǎng)上清液加入到正常無血清培養(yǎng)的肝細胞中，誘導肝細胞表達ICAM-1，JBP485于脾細胞培養(yǎng)基加入前1小時加入肝細胞，用RT-PCR、細胞免疫化學法分析ICAM-1的表達情況。(4)用96孔板培養(yǎng)脾淋巴細胞，細胞密度1.5 × 106cells/ml，Con A終濃度5μg/ml，作用時間60小時。分為空白組(只加培養(yǎng)基無細胞)、陽性對照組(5μg/ml Con A)、JBP485處理組，每組設(shè)

6、3個復孔。用MTT法測定各組OD值。 結(jié)果： (1)Con A對肝細胞產(chǎn)生濃度依賴的直接細胞毒性作用； (2)JBP485能夠明顯抑制Con A直接導致的肝細胞毒性，與模型I比較，JBP485處理組的培養(yǎng)上清液中AST、LDH的活性明顯降低(p＜0.01：p＜0.05)，TNF-α的含量也減少(p＜0.01)； (3)JBP485能夠明顯抑制ConA預處理的肝細胞與Con A預刺激的自體脾淋巴細胞相互作用

7、產(chǎn)生的肝細胞毒性作用，與模型Ⅱ比較，JBP485處理組的培養(yǎng)上清液中．AST、LDH的活性明顯降低(p<0.01；p＜0.05)； (4)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示JBP485能夠抑制Con A．直接導致和肝、脾淋巴細胞相互作用而導致的肝細胞DNA的片斷化：RT-PCR、細胞免疫化學結(jié)果顯示，模型I組沒有明顯的easpase-3表達變化，而模型Ⅱ組easpase-3表達明顯增加，JBP485顯著抑制了easpase-3的表達(p＜0

8、.05；p＜0.05)； (5)RT-PCR、細胞免疫化學結(jié)果顯示JBP485能夠明顯抑制細胞因子誘導的ICAM-1的表達(p＜0.05；p＜0.05)； (6)MTT結(jié)果顯示JBP485沒有明顯的抑制淋巴細胞增殖的作用。 結(jié)論： (1)JBP485對Con A導致的細胞毒有直接的肝細胞保護作用； (2)JBP485能夠通過抑制Con A在體外引起的DNA片段化，抑制肝、脾淋巴細胞相互作用引起的肝