JBP485對Con A誘導(dǎo)小鼠自身免疫性肝損傷的保護(hù)作用.pdf

1、目的： JBP485(cyclo-trans-4-L-Hydroxyprolyl-L-serine，環(huán)狀-反式-4-左旋-羥脯氨酰-左旋-絲氨酸)是首次從抗肝炎藥物藍(lán)內(nèi)克(Laennec)注射劑中分離出的一種二肽。目前，已經(jīng)用化學(xué)方法將JBP485人工合成。根據(jù)文獻(xiàn)報道，JBP485經(jīng)胃腸道吸收后對ANIT(α-naphthylisothiocyanate)和CCL4(carbon tetrachloride)致毒的大鼠具有抗炎

2、和肝保護(hù)作用。本課題旨在進(jìn)一步研究JBP485對Con A誘導(dǎo)的小鼠自身免疫性肝損傷所產(chǎn)生的肝保護(hù)作用，并對其可能的保護(hù)機(jī)制進(jìn)行初步探討。 方法： 采用尾靜脈注射法將刀豆球蛋白A(concanavalin A，Con A)注射入小鼠體內(nèi)，建立小鼠自身免疫性肝損傷模型。將雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為三組，即正常對照組、模型組、JBP485治療組。模型組和治療組分別將Con A(10mg/kg，1.5mg/ml)經(jīng)尾靜脈一次

3、性注射；正常對照組用生理鹽水代替Con A注射。注射Con A前0.5小時、注射后2小時、5小時，治療組小鼠分別用不同劑量的JBP485(3.125mg/kg、12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg；濃度分別為0.3125mg/ml、1.25mg/ml、2.5mg/ml、5.0mg/ml)灌胃給藥，對應(yīng)的模型組和正常對照組小鼠分別用等體積的生理鹽水代替治療藥物JBP485灌胃。注射Con A后8小時，將各實(shí)驗(yàn)組小鼠用摘除眼球

4、法取血，37℃靜置30分鐘后3000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，分離血清，測定血清中丙氨酸氨?；D(zhuǎn)移酶(Alanine　Aminotransferase，ALT)和乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase，LDH)的活力。經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析得出，JBP485對Con A性小鼠肝損傷具有肝保護(hù)作用，且其最佳治療劑量為25mg/kg。按上述實(shí)驗(yàn)方法和給藥時間，將JBP485的治療劑量確定為25mg/kg，在注射Con A后8小時，將水合

5、氯醛麻醉后的小鼠用頸椎脫臼法處死，立即取出肝臟，用預(yù)冷的生理鹽水將肝臟沖洗三遍，將肝臟表面的血液沖掉。然后將實(shí)驗(yàn)各組小鼠同一部位的肝組織(肝右葉)浸泡在4％福爾馬林溶液中固定，經(jīng)石蠟包埋、切片，HE染色后光鏡下觀察肝臟的組織形態(tài)學(xué)變化；用免疫組織化學(xué)方法檢測腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和細(xì)胞間黏附分子(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)在肝臟

6、組織中的表達(dá)。將其他部分肝組織加入組織勻漿液勻漿，測定肝組織中的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(maleic dialdehyde，MDA)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)和一氧化氮(nitric oxide，NO)的含量。小鼠在Con A注射后8小時，用小鼠肝灌流的方法分離各組小鼠的肝細(xì)胞。提取各組小鼠肝細(xì)胞中的DNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA損傷斷裂后的 DNA

7、Ladder；分別提取各組小鼠肝細(xì)胞中的總RNA，用RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction)法檢測凋亡相關(guān)基因bcl-2和bax在肝臟組織中的表達(dá)。 結(jié)果： 1．與正常對照組相比，模型組： (1)光鏡下組織形態(tài)學(xué)觀察，可見肝組織失去原有正常組織形態(tài)而呈明顯的病理損傷，表現(xiàn)肝細(xì)胞腫脹、胞漿著色變淺、肝細(xì)胞呈水腫狀、胞核增大、肝竇擴(kuò)張且有明顯的瘀血

8、、竇索結(jié)構(gòu)紊亂，伴大量炎癥細(xì)胞浸潤，可見片狀壞死灶。 (2)血清酶學(xué)檢測：ALT和LDH均顯著升高(p<0.01)，提示肝臟嚴(yán)重受損。 (3)肝組織MDA、MPO、NO水平顯著升高(p<0.01)，而SOD水平明顯降低(p<0.01)，表明Con A性肝損傷能夠致使肝細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化，氧自由基清除能力下降，白細(xì)胞浸潤增多，而且伴有NO性損傷。 (4)免疫組織化學(xué)，檢測肝組織TNF-α和ICAM-1表達(dá)均顯著增強(qiáng)

9、。 (5)DNA Ladder檢測可見模型組DNA呈明顯的階梯狀，說明Con A性肝損傷還涉及到DNA的斷裂損傷。 (6)RT-PCR檢測凋亡相關(guān)基因bcl-2/bax比值降低(p<0.05)，提示模型組肝損傷還與細(xì)胞凋亡有關(guān)。 2．與模型組相比，JBP485治療組： (1)組織形態(tài)學(xué)上觀察，肝臟的受損程度明顯減弱，表現(xiàn)為壞死面積縮小或不明顯，肝細(xì)胞膨脹減輕，胞核變小，肝小葉邊界明顯，肝索清晰，炎性細(xì)胞浸

10、潤大大減少。 (2)肝細(xì)胞受損程度明顯減輕，表現(xiàn)為血清ALT及LDH水平顯著降低(p<0.01和p<0.05)，且JBP485的治療效果具有劑量依賴性。 (3)肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷及白細(xì)胞浸潤減輕，自由基清除能力增強(qiáng)，表現(xiàn)為肝臟MDA及MPO含量減少(p<0.01，p<0.01)及SOD活力恢復(fù)(p<0.01)；NO的生成量也減少(p<0.05)。 (4)肝組織中TNF-α和ICAM-1表達(dá)減弱。 (5)

11、DNA Ladder顯示肝細(xì)胞的DNA斷裂損傷程度也明顯減弱。 (6)凋亡相關(guān)基因bcl-2/bax比值升高(p<0.05)。 結(jié)論：JBP485對Con A引起的自身免疫性肝損傷有肝保護(hù)作用，其作用機(jī)制為： 1．增強(qiáng)肝組織自由基清除能力、抑制肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷； 2．減弱因NO過度表達(dá)而引起的細(xì)胞毒作用； 3．減少炎性細(xì)胞在炎癥和組織損傷區(qū)域的聚集； 4．抑制炎性細(xì)胞因子的釋放;