脂筏-神經酰胺在TNF-α介導的人氣道上皮細胞NF-κB激活及雙重氧化酶DUOX-1表達中的作用.pdf

1、在基因組學與蛋白質組學領域，已經有許多令人矚目的研究成果。隨著脂質組學概念的提出，人們日益發(fā)現脂質的功能并不僅僅只局限于以前所認識到的，它們在生物領域發(fā)揮的作用可能超出了人們的想象。脂筏就是一種位于細胞膜上由脂質構成的功能單位體。它由豐富的鞘脂、膽固醇及特定的蛋白質動態(tài)聚集而成，形成相對穩(wěn)定的具有一定功能的筏結構漂浮于流動的細胞膜中。當細胞受到某種刺激時，脂筏被酸性鞘磷脂酶（ASM）激活并釋放出大量由鞘磷脂水解而來的神經酰胺，后者迅速相

2、互聯(lián)接形成微區(qū)，這些微區(qū)又可以迅速聯(lián)結形成一個或幾個平臺區(qū)。神經酰胺富含膜區(qū)為蛋白質等生物活性分子之間的相互作用提供了平臺。脂筏廣泛參與了細胞的各種生物學行為，在信號轉導中發(fā)揮的作用尤為重要。支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病,與多種炎癥細胞及炎癥介質相關，氣道上皮細胞是氣道炎癥的主要效應細胞。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是哮喘炎癥過程中重要的啟動因子，它可以通過激活NF-κ B誘導一系列炎癥介質的產生，導致氣道上皮細胞損傷以及氣道粘

3、液過度分泌。NF-κ B 廣泛存在于各種組織細胞，能與多種基因啟動子上κ B 序列結合并促進轉錄，通過調控許多重要的細胞因子，粘附分子，趨化因子的基因表達而參與機體的各種免疫炎癥反應。DUOX-1是糖蛋白p91Phox的同系物，可以表達于氣道上皮細胞，能夠催化其底物產生過氧化氫，引起細胞損傷并刺激細胞分泌大量粘液。本研究擬探討脂筏-神經酰胺通路在TNF-α引起的NF-κ B 激活以及其下游靶基因的表達中是否發(fā)揮作用，以期為哮喘等氣道炎癥

4、性疾病的防治提供新的策略。
　　 目的：人氣道上皮細胞膜脂筏-神經酰胺被破壞后，TNF-α刺激細胞引起的NF-κ B 激活及DUOX1表達所受到的影響。DUOX1的表達是否依賴NF-κ B的激活。
　　 方法：⑴基于ELISA的轉錄因子活性測定方法檢測細胞內NF-κ B活性。用5ng/ml,10ng/ml,15ng/ml TNF-α分別處理人氣道上皮細胞15min,30min,60min。選取能最大程度激活NF-κ B的

5、TNF-α濃度和刺激時間進行細胞分組實驗并檢測細胞內NF-κ B活性。①對照組②TNF-α刺激組：10ng/mlTNF-α處理細胞15min。③膽固醇剔除劑甲基-β-環(huán)糊精（M-β-CD）M-β-CD組：10mM M-β-CD 處理細胞30min。④MT組：M-β-CD 處理細胞后再用TNF-α刺激細胞。⑤膽固醇結合劑菲律賓菌素Ⅲ(Filipin Ⅲ)，Filipin組：用6ug/ml Filipin 處理細胞1 小時。⑥FT組：用Fi

6、lipin 處理細胞后再用TNF-α刺激細胞。⑦酸性鞘磷脂酶抑制劑地昔帕明（Desipramine），Desipramine組：10 μM Desipramine 處理細胞1 小時。⑧DT組：用Desipramine 處理細胞后再用細胞因子刺激細胞。⑵Western blot檢測細胞DUOX-1的表達。細胞分組為：①對照組②TNF-α刺激組：10ng/ml TNF-α處理細胞3 小時。③M-β-CD組：10mM M-β-CD 處理細胞3

7、0min。④MT組：M βCD 處理細胞后再用TNF-α刺激細胞。⑤Desipramine組：10 μMDesipramine 處理細胞1 小時。⑥DT組：Desipramine 處理細胞后再用TNF-α刺激細胞。⑶免疫組化觀察細胞漿中DUOX-1的表達。細胞分組為：①對照組②TNF-α刺激組：10ng/ml TNF-α處理細胞3 小時。③MT組：10mM M-β-CD 處理細胞30min后再用TNF-α刺激細胞。④DT：10 μM D

8、esipramine 處理細胞1 小時細胞后再用TNF-α刺激細胞。⑷DNA decoy。細胞分組為：①對照組。②TNF-α刺激組：10ng/ml TNF-α處理細胞3 小時。③轉染試劑組：轉染試劑處理細胞過夜。④DNA轉染組：用轉染試劑將DNA 雙鏈轉染到細胞內后，再用10ng/ml TNF-α處理細胞。⑸統(tǒng)計分析：單因素方差分析。
　　 結果：①10ng/ml TNF-α處理氣道上皮細胞15min 激活細胞內NF-κ B 最

9、明顯（P<0.05）。脂筏干擾劑可以抑制TNF-α刺激引起的NF-κ B活性增加（P<0.05）。②TNF-α刺激細胞引起DUOX-1表達增加（P<0.05）。脂筏干擾劑可以抑制TNF-α刺激引起的DUOX-1表達增加（P<0.05）。③TNF-α刺激細胞后，在電鏡下其胞漿中DUOX-1 顆粒明顯增加。脂筏干擾劑可以抑制TNF-α刺激引起的DUOX-1 顆粒增加。④NF-κ B的DNA結合序列轉染到細胞內后可以抑制 TNF-α刺激引起的