阿司匹林抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB活化在瘢痕疙瘩治療中作用的實驗研究.pdf

1、瘢痕疙瘩是機體對損傷的異常愈合反應(yīng)，以成纖維細(xì)胞的增殖異常和細(xì)胞外基質(zhì)成分的過度堆積為主要特征，其發(fā)病機制至今不明。在治療上尚無特效方法，是目前整形外科研究的熱點和難點問題。 近年來的研究表明核因子-KB(nuclear factor-K3 NF-KB)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路貫穿于創(chuàng)傷修復(fù)與愈合的整個生物學(xué)過程，它是信號從細(xì)胞表面轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)部的重要傳遞者；參與細(xì)胞生長、發(fā)育、凋亡等多種生理功能，并在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、纖維化等方面起重要作用。

2、越來越多的研究表明：許多疾病的發(fā)生和發(fā)展都與NF-KB的過度活化有關(guān)，以NF-KB為作用靶點治療或緩解疾病已經(jīng)成為研究熱點。 以NF-KB為作用靶點治療或緩解疾病已經(jīng)成為研究熱點。阿司匹林是重要的非甾體類抗炎藥NSAIDs，主要通過抑制環(huán)氧化酶(COX)進而抑制前列腺素E<,2>的合成，控制炎癥反應(yīng)。最近研究證實，阿司匹林可以呈劑量和時間依賴性抑制NF-K3的活化，具有治療和預(yù)防腫瘤的作用。 研究表明瘢痕疙瘩在臨床特征、

3、基因突變、細(xì)胞因子與受體及治療方法等方面與腫瘤具有相似性，正常皮膚和瘢痕疙瘩來源的成纖維細(xì)胞在基因表達(dá)和細(xì)胞凋亡方面有顯著的差異，瘢痕疙瘩來源的成纖維細(xì)胞具有較強的增殖能力和耐受細(xì)胞死亡的能力--即凋亡抗性。 目的: 本研究擬利用臨床收集的瘢痕疙瘩以及正常皮肽標(biāo)本，觀察NF-KB信號傳導(dǎo)通路關(guān)鍵基因p65、其上游抑制基因IκB-α以及下游靶基因cyclinD1在組織中的靜息狀態(tài)表達(dá)水平是否存在差異。選擇在瘢痕疙瘩發(fā)病中起

4、主要作用的成纖維細(xì)胞作為進一步觀察對象，原代培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，利用細(xì)胞外源性細(xì)胞因子一腫瘤壞死因子-α(TNF-α)作為NF-κB信號傳導(dǎo)通路的活化劑，觀察TNF-α對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞(KFs)的增殖的影響；對NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路p65、1κB-α以及cyclinD1動態(tài)變化規(guī)律的影響：并與正常皮膚成纖維細(xì)胞(NFs)相比較。 選擇阿司匹林作為NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的有效阻滯劑，采用不同濃度阿司匹林預(yù)處理KFs后，再給予TNF

5、-α刺激細(xì)胞，觀察對NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上、下游相關(guān)基因p65、IκB-α以及cyclinD1的影響：對KFs增殖、細(xì)胞周期和凋亡的影響。 方法: 收集臨床標(biāo)本，包括15例瘢痕疙瘩組織以及10例正常皮膚。采用組織免疫組織化學(xué)方法分析標(biāo)本中NF-κB p65蛋白表達(dá)；提取mRNA以及核蛋白，實時熒光定量RT-PCR檢測組織中IκB-α的轉(zhuǎn)錄水平以及TransAM<'TM> NF-vd3 p65試劑盒檢測NF-κB p65

6、的DNA結(jié)合活性水平；利用Western blot技術(shù)檢測細(xì)胞周期蛋白D1(cyclinD1)的蛋白水平。 組織塊法培養(yǎng)瘢痕疙瘩以及正常皮膚成纖維細(xì)胞；取第4-8代細(xì)胞用于實驗。分別應(yīng)用10 ng/ml、50 ng/ml以及100 ng/ml TNF-α處理瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞24 h、48 h、72 h、96 h以及120 h，MTT法觀察TNF-α對細(xì)胞增殖的影響；應(yīng)用50 ng/mlTNF-α刺激成纖維細(xì)胞15 min、30

7、 min、1 h、2h以及4h，免疫熒光技術(shù)觀察NF-κBP65和1κ-α在靜息狀態(tài)和TNF-α刺激后在成纖維細(xì)胞的亞細(xì)胞分布；收集成纖維細(xì)胞，提取細(xì)胞核蛋白以及細(xì)胞漿蛋白，用TransAM<'TM> NF-κB p65試劑盒檢測細(xì)胞核NF-κB p65的DNA結(jié)合活性，Western blot技術(shù)檢測細(xì)胞漿IκB-α蛋白表達(dá)。 取原代培養(yǎng)的KFs，分為空白對照組、50ng/mlTNF-α處理組、1.0mM、2.5 mM、5.0

8、mM以及10.0 mM阿司匹林預(yù)作用2h后合并TNF-α再處理組，作用時間為15min，抽提細(xì)胞漿與細(xì)胞核蛋白，應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測細(xì)胞漿IκB-α以及p-1κBα蛋白表達(dá)水平，TransAM<'TM> NF-κB p65 Kit試劑盒檢測細(xì)胞核NF-κBp65 DNA結(jié)合活性水平；同樣上述分組而TNF-α再作用時間改為1h，免疫熒光技術(shù)觀察NF-κB P65及其上游抑制因子IκB-α在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的亞細(xì)胞分布；

9、1.0mM、2.5mM、5.0 mM、10.0mM阿司匹林預(yù)作用細(xì)胞2h后TNF-α再分別處理24h、48h、72h、96h、120h，MTT法檢測阿司匹林的抗成纖維細(xì)胞增殖效應(yīng)；1.0mM、5.0 mM、10.0mM阿司匹林預(yù)作用細(xì)胞2h后TNF-α再處理24h，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測不同處理組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的凋亡率以及對細(xì)胞周期的影響。結(jié)果瘢痕疙瘩組織在靜息狀態(tài)下存在著NF-κB的持續(xù)活化，表現(xiàn)為NF-κB p65在瘢痕疙瘩中蛋白表

10、達(dá)以及DNA結(jié)合活性高于正常皮膚，NF-κB通路上游抑制因子IκB-α在瘢痕疙瘩中轉(zhuǎn)錄水平低于正常皮膚組織，下游靶基因cyclinDl蛋白表達(dá)水平高于正常皮膚。 不同濃度TNF-α處理瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，在低濃度時隨著濃度增加具有促進其增殖的作用，最大刺激增殖濃度為50ng/ml TNF-α，當(dāng)濃度達(dá)到100ng/mlTNF-α?xí)r，則出現(xiàn)抑制其生長作用；TNF-α刺激成纖維細(xì)胞后，細(xì)胞漿p-κB-α蛋白水平在刺激后15min升高

11、至最高值，4h基本檢測不到；細(xì)胞漿IκB-α蛋白水平在刺激后15min降至最低值，4h基本接近正常；NF-κB P65從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核；NFκB p65 DNA結(jié)合活性水平在刺激后1h達(dá)到高峰，4h接近正常；在各個時間點，IκB-κ蛋白表達(dá)水平以及NF-κB p65 DNA結(jié)合活性水平的變化幅度KFs較NFs劇烈，對TNF-α的刺激更為敏感。 阿司匹林預(yù)處理后聯(lián)合TNF-α作用于成纖維細(xì)胞，可以阻止細(xì)胞漿IκB-α的磷酸化和

12、降解，抑制NF-κB P65的細(xì)胞核移位，降低NF-κB p65 DNA結(jié)合活性，表現(xiàn)為阿司匹林呈劑量和時間依賴性促進KFs TNF-α誘導(dǎo)的凋亡，使KFs滯留于GO期，抑制KFs的增殖。 結(jié)論: 1．NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的上游抑制因子IκB-α在瘢痕疙瘩的表達(dá)低于正常皮膚對照組，而NF-κB p65 DNA蛋白結(jié)合活性以及其下游靶基因cyclnD1蛋白表達(dá)水平高于正常皮膚對照組，這種異常暗示NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能

13、參與了瘢痕疙瘩的發(fā)生機制。 2．KFs對不同濃度的TNF-α的反應(yīng)不一致，低濃度TNF-α可刺激KFs增殖，高濃度TNF-α可抑制其增殖。 3．與NFs相比較，KFs對于低濃度的TNF-α的刺激反應(yīng)更為強烈，表現(xiàn)在NF-KB信號通路相關(guān)基因的變化幅度較大，這種差異有可能是造成KFs異常增殖和凋亡抗性產(chǎn)生的原因。 4．阿司匹林可以有效阻止TNF-α誘導(dǎo)的NF-KB上游抑制因子IKB-α的磷酸化和降解，阻止NF-KB